本文關鍵詞：微生物脂肪酶庫構建及磷脂酶D的篩選與應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂肪酶作為工業(yè)大宗酶之一,能夠催化水解、酯合、酯交換、醇解、酸解、氨解等反應,被廣泛地用于食品、醫(yī)藥、紡織、飼料、洗滌、造紙、生物柴油及環(huán)境保護等領域。微生物脂肪酶相比于動植物來源脂肪酶具有來源廣泛、易于制備、底物特異性較強、催化效率較高、反應條件溫和、副產(chǎn)物較少等優(yōu)點。伴隨著脂肪酶應用范圍的擴大,對其特異性的要求也逐漸提高,從自然界中篩選特異性脂肪酶菌株是一個較為簡便可行的方法。利用維多利亞藍和皂化鈣圈的方法我們從19份內陸土壤樣品和22份南海深海沉積物樣品中平板初篩獲得538株產(chǎn)酶菌株。復篩我們采用特異性酶活測定方法,脂肪酶水解活力采用p-NP法,磷脂酶D水解酶活力采用酶聯(lián)比色法,酯合活力采用棕櫚酸乙酯法,轉酯活力采用DHA甘油酯法。復篩結果顯示538株初篩菌株中具有脂肪酶水解活力的菌株有295株；具有PLD水解活力菌株有293株；具有酯合成活力的菌株有138株：具有酯交換活力的菌株有23株。具有較高水解活力的菌株有57株：較高PLD水解活力的菌株有55株：較高酯合活力的菌株有3株。其中水解酶和PLD酶的相關度為45.08%,水解酶和酯合酶的相關度為27.5%,酯合酶和酯交換酶的相關度為82.1%。我們對部分南海特異性菌株進行了16S rDNA鑒定分析,發(fā)現(xiàn)變形桿菌門占絕對優(yōu)勢,其中嗜冷菌、芽孢桿菌、交替假單胞菌為優(yōu)勢菌屬。脂肪酶庫中538號菌株經(jīng)過16S rDNA鑒定為麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),通過硫酸銨沉淀、DEAE離子交換層析和凝膠過濾層析獲得電泳純蛋白條帶。蛋白質測序發(fā)現(xiàn)其屬于Ⅰ型磷脂酶含有GxSxG保守序列,相對分子質量為41.8 KD,等電點為8.86。酶學性質研究發(fā)現(xiàn)該酶最適的催化溫度為40℃,最適pH為7-8,在10-40℃內能夠保持酶活的穩(wěn)定性,在pH 5-12的范圍內能夠維持80%以上活力,金屬離子Fe3+和化學試劑SDS能夠抑制90%以上的酶活。磷脂酶D(Phospholipid D,EC 3,1.4.4,縮寫PLD)能夠催化水解磷脂分子中4位酯鍵,生成磷脂酸和有機堿：同時,還能通過堿基交換反應催化各種羥基化合物與磷脂堿基結合形成新的磷脂。目前報道的大部分PLD的水解活性遠高于轉堿基活性,這限制了其在制備單一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性過程的應用。本研究以脂肪酶庫中具有PLD水解活力菌株及大豆磷脂殘渣為樣品篩選具有堿基交換活性的PLD菌株,并將其用于磷脂酰絲氨酸合成。通過大量的篩選我們共獲得了6株具有磷脂酰絲氨酸合成能力菌株,分別對其進行了16S rDNA鑒定。其中a2菌株經(jīng)過鑒定為抗輻射不動桿菌(Acinetobacter radioresistens),其在雙相體系中50℃反應12h磷脂酰絲氨酸的轉化率為47.8%,選擇率為74%,具有很好的應用前景。利用H103大孔樹脂對Acinetobacter radioresistens a2的PLD進行純化。步純化獲得了電泳純PLD蛋白,其相對分子量在40 KD左右。
【關鍵詞】：脂肪酶 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 磷脂酶D 抗輻射不動桿菌 磷脂酰絲氨酸
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-37
• 0.1 脂肪酶14-24
• 0.1.1 脂肪酶簡介14-17
• 0.1.2 脂肪酶特性17-20
• 0.1.3 脂肪酶的應用20-24
• 0.2 磷脂改性與磷脂酶D24-35
• 0.2.1 磷脂簡介24-25
• 0.2.2 磷脂酰絲氨酸簡介25-26
• 0.2.3 磷脂改性的方法26-30
• 0.2.4 磷脂酶D簡介30-31
• 0.2.5 磷脂酶D的催化特性31-35
• 0.3 研究意義和主要研究內容35-37
• 0.3.1 研究意義35-36
• 0.3.2 研究內容36-37
• 1 微生物脂肪酶庫構建及南海產(chǎn)脂肪酶微生物多樣性分析37-64
• 1.1 引言37-38
• 1.2 材料與方法38-50
• 1.2.1 樣品信息38-40
• 1.2.2 儀器與試劑40-41
• 1.2.3 培養(yǎng)基配方41-42
• 1.2.4 產(chǎn)脂肪酶微生物篩選42-49
• 1.2.5 細菌16S rDNA鑒定49-50
• 1.3 結果與討論50-62
• 1.3.1 產(chǎn)酶微生物酶活多樣性分析50-51
• 1.3.2 南海產(chǎn)脂肪酶微生物多樣性分析51-62
• 1.4 本章小結62-64
• 2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌LH15脂肪酶的純化及酶學性質研究64-76
• 2.1 引言64
• 2.2 材料與方法64-68
• 2.2.1 儀器與試劑64
• 2.2.2 菌株64
• 2.2.3 培養(yǎng)基配方64-65
• 2.2.4 酶活測定方法65
• 2.2.5 蛋白質測定方法65
• 2.2.6 LH15生長曲線測定65
• 2.2.7 LH15純化65-66
• 2.2.8 SDS-PAGE檢測66-67
• 2.2.9 LH15酶學性質67-68
• 2.2.10 蛋白測序68
• 2.3 結果與討論68-75
• 2.3.1 LH15的生長曲線68-69
• 2.3.2 LH15進化分析69
• 2.3.3 LH15脂肪酶的純化69-70
• 2.3.4 SDS-PAGE檢測70-71
• 2.3.5 LH15脂肪酶的酶學性質71-73
• 2.3.6 蛋白測序73-75
• 2.4 本章小結75-76
• 3 具有轉堿基活性的磷脂酶D菌株篩選76-85
• 3.1 引言76
• 3.2 材料與方法76-79
• 3.2.1 樣品信息76-77
• 3.2.2 儀器與材料77
• 3.2.3 培養(yǎng)基配方77
• 3.2.4 具有轉堿基活性的PLD菌株篩選77-78
• 3.2.5 雙水相磷脂酰絲氨酸合成78
• 3.2.6 磷脂酰絲氨酸檢測78-79
• 3.2.7 細菌鑒定及進化分析79
• 3.3 結果與討論79-83
• 3.3.1 脂肪酶庫篩選結果79-80
• 3.3.2 大豆磷脂殘渣中篩選80-81
• 3.3.3 具有轉堿基活性菌株16S rDNA鑒定81-82
• 3.3.4 具有轉堿基活性菌株進化分析82-83
• 3.4 本章小結83-85
• 4 抗輻射不動桿菌a2催化合成磷脂酰絲氨酸及其發(fā)酵純化85-90
• 4.1 引言85
• 4.2 材料與方法85-87
• 4.2.1 儀器與試劑85
• 4.2.2 材料85-86
• 4.2.3 a2催化合成磷脂酰絲氨酸86
• 4.2.4 磷脂酰絲氨酸檢測86
• 4.2.5 a2 PLD純化86
• 4.2.6 磷脂酶D水解活力測定86
• 4.2.7 蛋白質含量測定86-87
• 4.2.8 SDS-PAGE電泳87
• 4.3 結果與討論87-89
• 4.3.1 a2 PLD催化合成PS87-88
• 4.3.2 a2 PLD純化88-89
• 4.4 本章小結89-90
• 5 總結與展望90-95
• 5.1 引言90-91
• 5.2 總結91-92
• 5.3 本論文的不足92-93
• 5.4 展望93-95
• 參考文獻95-102
• 致謝102-103
• 個人簡歷103

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