長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA。盡管lncRNA被報(bào)道參與了諸多生物學(xué)過程,其生物學(xué)意義和分子機(jī)制仍不十分清晰,并且存在諸多爭(zhēng)議。反向遺傳學(xué)技術(shù)是揭示lncRNA生物學(xué)功能的重要研究手段,然而眾多相關(guān)研究表明現(xiàn)有的研究技術(shù)通常具有較高的非特異性作用和脫靶效應(yīng),或無法準(zhǔn)確判斷表型變化是否由轉(zhuǎn)錄本導(dǎo)致。除了技術(shù)上的限制,lncRNA本身特征,如與功能元件重疊、尚不明確的作用機(jī)制、可變剪切、核定位和豐度低等,都使其功能研究充滿挑戰(zhàn)。本課題研究一類新型lncRNA,極長(zhǎng)基因間非編碼RNA（very long intergenic non-coding RNAs,vlincRNAs）,應(yīng)用最新的反向遺傳學(xué)技術(shù)CRISPR/Cas13系統(tǒng),對(duì)vlincRNA進(jìn)行功能鑒定。該方法具有比其他現(xiàn)有方法（如RNAi）更高的特異性,并且靶向RNA而非DNA（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）,于是可以準(zhǔn)確地將表型分配給轉(zhuǎn)錄本。生存篩選是指抗癌藥物作用于癌細(xì)胞造成壓力使細(xì)胞傷亡或存活的過程。本課題將CRISPR/Cas13系... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

靶向不同對(duì)象的反向遺傳學(xué)技術(shù)

第2章基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料與方法11圖2.1Cas13質(zhì)粒和gRNA質(zhì)粒示意圖人類慢性髓系白血病細(xì)胞K562（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)），是一種懸浮細(xì)胞，已經(jīng)有研究表明，K562細(xì)胞系是常見細(xì)胞系中vlincRNA含量較多的一種[22]，這使得K562細(xì)胞系非常適合用于研究vlincRNA。本課題的所有改造細(xì)胞系都是由K562細(xì)胞改造獲得。2.1.2藥物本課題選擇了三種抗腫瘤藥物，分別是依托泊苷（Etoposide，AbMoleBioScience，美國(guó)），拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，可誘導(dǎo)DNA損傷，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。米林（Mirin，AbMoleBioScience，美國(guó)），是DNA雙鏈斷裂感應(yīng)因子MRE11A的抑制劑，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。伊馬替尼（Imatinib，AbMoleBioScience，美國(guó)），K562的癌基因BCR-ABL的抑制劑，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。這三種抗腫瘤藥物將會(huì)作為接下來篩選研究vlincRNA以及生存篩選實(shí)驗(yàn)的壓力來源。Etoposide在臨床上以用于治療包括白血病的多種癌癥[49]，并且在許多DNA損傷相關(guān)研究中作為DNA損傷誘導(dǎo)劑[48]，Imatinib是治療慢性骨髓性白血病的藥物，對(duì)由于染色體易位產(chǎn)生的費(fèi)城染色體導(dǎo)而導(dǎo)致的慢性骨髓性白血病治療效果十分顯著[50]。盡管Mirin沒有在臨床上用于治療惡性腫瘤，但是，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的早期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Mirin可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞

第3章CRISPR/Cas13細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建21圖3.1Cas13mRNADox誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)3.2篩選備選vlincRNA及mRNA3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了選擇合適的研究對(duì)象vlincRNA，我們?cè)O(shè)計(jì)了如圖3.2所示的實(shí)驗(yàn)流程。將K562細(xì)胞，用Etoposide、Mirin或Imatinib處理3小時(shí)和6小時(shí)，并且提取處理前后的總RNA，進(jìn)行RNA-seq，根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)的結(jié)果，篩選出合適的備選vlincRNA.


本文編號(hào)：3110636