作為毛紡產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)原材料,絨山羊所產(chǎn)的羊絨纖細柔軟。但如今在絨山羊育種過程中存在為提高羊絨產(chǎn)量盲目雜交,造成羊絨質(zhì)量降低等問題,亟待以現(xiàn)代生物技術實現(xiàn)品種改良。胸腺素β4（Thymosinbeta4,Tβ4）可以誘導毛囊形成進而調(diào)節(jié)哺乳動物毛發(fā)生長,加速毛囊干細胞的分化、遷移,還可通過促進血管生成達到間接促進毛發(fā)生長的作用。本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在絨山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞上進行Tβ4基因的定點敲入,結合體細胞核移植技術獲得Tβ4基因定點敲入的絨山羊,為絨山羊的遺傳育種提供新的方法。1、Tβ4基因定點整合載體的構建使用麻省理工學院的CRISPR設計軟件在CCR5的第二外顯子上設計了 6對20bp的靶序列,以gRNA-T2為模板,使用整體PCR的方法,擴增得到大小為455bp的gRNA。利用surveyor突變檢測試劑盒進行效率檢測,最終確定了一對突變效率較高的gRNA,用于下一步實驗。同時構建了由上游同源臂、Kap6.1啟動子、Tβ4基因、polyA和下游同源臂5部分組成的Tβ4同源重組載體。2、Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得采用電穿孔轉染法將Cas9環(huán)狀質(zhì)粒、4... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述
    1 CRISPR-Cas9的研究進程
    2 CRISPR-Cas9的基因座結構
    3 CRISPR-Cas9的作用原理
    4 CRISPR-Cas9在動物基因編輯上的應用
    5 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢與局限
    6 結語
第二章 CRISPR/Cas9介導絨山羊Tβ4基因定點敲入的研究
    1 引言
        1.1 Tβ4基因定點整合載體的構建
        1.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
        1.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要儀器設備
            2.1.2 試劑與耗材
            2.1.3 實驗材料
        2.2 方法
            2.2.1 Tβ4基因定點整合載體的構建
            2.2.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
            2.2.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
    3 結果
        3.1 Tβ4基因定點整合載體的構建
            3.1.1 gRNA表達載體的構建
            3.1.2 SURVEYOR酶切效率檢測
            3.1.3 Tβ4基因的獲得
            3.1.4 上下游同源臂的獲得
            3.1.5 Tβ4同源重組載體的構建
        3.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
            3.2.1 單克隆細胞系的獲得
            3.2.2 Tβ4基因隨機整合細胞系的鑒定
            3.2.3 Tβ4基因定點整合細胞系的鑒定
        3.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
            3.3.1 卵母細胞的采集與體外成熟
            3.3.2 重構胚的構建及融合
            3.3.3 重構胚的體外培養(yǎng)及移植
            3.3.4 轉基因絨山羊的接產(chǎn)及鑒定
    4 討論
        4.1 Tβ4 基因定點整合載體的構建
        4.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
        4.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
結論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3021072