精子發(fā)生是一個復雜的生物學過程,這一過程需要生精細胞和睪丸體細胞的協(xié)同作用。睪丸生精小管中具有多種細胞,支持細胞作為對睪丸具有重要功能的一種體細胞,可形成血-睪屏障,分泌多種分泌因子,還可以為生殖細胞提供生物學上的支持,如果支持細胞的基因表達調控發(fā)生異常,可能會導致精子發(fā)生的障礙,從而導致雄性不育。研究表明,microRNAs（miRNAs）對支持細胞的增殖、分泌和凋亡具有一定調控作用。本實驗室前期轉錄組數據分析,發(fā)現(xiàn)miRNA-34c和miRNA-449b在初生公牛和成年公牛的睪丸組織中差異表達,我們推測miRNA-34c和miRNA-449b可能在公牛的精子發(fā)生過程中具有調控作用,但作用及其機制尚不清楚。本研究構建miRNA-34c和miRNA-449b的干擾和過表達載體,采用EdU和qRT-PCR檢測鑒定了miRNA-34c和miRNA-449b對支持細胞增殖和分泌功能的影響,并通過流式細胞術和TUNEL,檢測了miRNA-34c和miRNA-449b對牛支持細胞細胞凋亡的影響。結果表明:miRNA-34c和miRNA-449b對睪丸支持細胞均有調控作用,其中:當miRNA-34... 

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2 EdU法檢測牛支持細胞增殖

圖1.2.1A中結果顯示,與對照組相比,當轉染miRNA-34c mimics時,miRNA-34c的表達水平極顯著的提高（p<0.0001）,當轉染miRNA-34c inhibitor后,miRNA-34c的表達水平顯著的降低（p<0.01）。從圖1.2.1B、C和D中可以看出,與對照組相比,轉染miRNA-34c mimics后,細胞增殖基因PCNA、BCL2和BCL2L2的表達水平降低（p<0.01）,而轉染miRNA-34c inhibitor后,細胞增殖基因PCNA、BCL2和BCL2L2的表達水平升高（p<0.01）。從圖1.2.1E中可以看出,miRNA-34c過表達時,支持細胞分泌因子GDNF、BMP4和CXCL12的表達水平降低（p<0.05）,而miRNA-34c被抑制時,結果與miRNA-34c mimics結果相反,其中,細胞分泌因子GDNF和CXCL12的表達水平均顯著升高（p<0.01）。從這些實驗結果我們可以看出,miRNA-34c抑制了初生牛睪丸支持細胞的增殖基因和分泌因子的標的水平.通過F和G圖,我們可以看出,miRNA-34c過表達時,雄激素結合受體ABP的表達含量降低,當miRNA-34c被抑制時,ABP含量升高。圖1.2.1 Mi RNA-34c對增殖相關基因和分泌因子的表達量的調控

圖1.2.1 Mi RNA-34c對增殖相關基因和分泌因子的表達量的調控向六孔板中加入等量的支持細胞,約1.3×105個細胞,并將細胞鋪布均勻,待細胞約長至約70%至80%時,進行轉染,36h時用EdU方法檢測細胞增殖情況。圖1.2.2通過EdU檢測細胞增殖的的結果可以看出,miRNA-34c過表達后增殖的陽性細胞數減少,而miRNA-34c被抑制后增殖的陽性細胞信號增加。EdU的實驗結果和增殖基因的表達水平說明miRNA-34c抑制了初生牛睪丸支持細胞的增殖。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]microRNA-132對腎間質成纖維細胞分泌細胞外基質的調控作用[J]. 朱慧萍,蘇震,周宏偉,章慧娣,黃朝興.  溫州醫(yī)學院學報. 2013(07)

博士論文
[1]MicroRNA-143對脂肪細胞分泌功能和膽固醇流出的影響及機制研究[D]. 邢鈺.中南大學 2012



本文編號：2992312