CRISPR/Cas9是發(fā)現(xiàn)于古細菌和細菌中的一種獲得性免疫防御機制,通過攝取入侵的外源DNA短片段最終形成宿主的間隔序列,從而介導對病毒和質粒的獲得性抗性。由于該系統(tǒng)相對于以前的基因編輯方法更簡單易行、可靠高效、靶標精準而被廣泛應用到多種生物的基因編輯中,成為一個準確打靶的基因編輯工具。本研究以本氏煙草為材料,利用CRISPR/Cas9技術實現(xiàn)本氏煙草內源PDS（Phytoenedesaturase,八氫番茄紅素脫氫酶）基因和外源GFP（Green Fluorescent Protein,綠色熒光蛋白）基因的編輯工作,建立了本氏煙草CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的瞬時表達系統(tǒng)和穩(wěn)定遺傳轉化體系,進而探討了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應用,為將來開展其它內源基因的生物學功能研究奠定了基礎。本論文針對本氏煙草內源基因PDS和外源基因GFP分別預測了 3個和4個靶標位點,并設計合成了相應的guide序列和構建了雙元表達重組載體。其中,將中間克隆載體psgR-Cas9-At質粒成功地改造成了操作性強的In-Fusion克隆載體psgR-Cas9-IF-At。將成功構建... 

【文章來源】：內蒙古大學內蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 CRISPR/CAs9和PTG技術
        1.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展及分類
        1.1.2 CRISPR/Cas的組成和結構
        1.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機制
        1.1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用
        1.1.5 CRISPR/Cas9的多位點編輯技術
        1.1.6 CRISPR/Cas9與ZFNs和TALENs的比較
    1.2 植物組織培養(yǎng)及穩(wěn)定轉化
        1.2.1 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷程
        1.2.2 植物組織遺傳轉化
        1.2.3 植物瞬時表達
        1.2.4 模式植物本氏煙草
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料與試劑
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 克隆載體
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 靶位點的預測,guide序列的設計及克隆
        2.2.2 重組子的雙元表達載體亞克隆
        2.2.3 利用In-Fusion克隆技術構建編輯載體
        2.2.4 PDS基因多個位點編輯的載體克隆
        2.2.5 pGREB32重組載體的構建
        2.2.6 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.7 農桿菌介導真空注射法侵染本氏煙草葉片
        2.2.8 CTAB法提取煙葉片草基因組DNA
        2.2.9 基因組RE-PCR
        2.2.10 基因組PCR-RE
        2.2.11 本氏煙草瞬時表達系統(tǒng)中多位點編輯效果的檢測
        2.2.12 本氏煙草葉圓盤轉化
第三章 實驗結果與分析
    3.1 PDS靶位點GUIDE序列的克隆
        3.1.1 PDS基因的靶標位點guide序列的克隆
        3.1.2 GFP基因的靶標位點guide序列的克隆
    3.2 PCAMBIA-GUIDE雙元表達重組載體的構建
    3.3 本氏煙草瞬時表達編輯效果的鑒定
        3.3.1 PDS基因組DNA-RE PCR鑒定
        3.3.2 基因組DNA PCR-RE鑒定
    3.4 PTG技術多位點克隆
    3.5 PDS基因多位點編輯效果的檢測
    3.6 本氏煙草再生體系的建立及穩(wěn)定遺傳株系的獲得
        3.6.1 本氏煙草遺傳轉化體系的建立
第四章 討論
    4.1 瞬時表達的CRISPR/CAS9系統(tǒng)的編輯效果分析
    4.2 CRISPR/CAs9系統(tǒng)在本氏煙草穩(wěn)定遺傳轉化的探究
參考文獻
附錄1
致謝
攻讀碩士學位期間取得的成果


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2966912