目的:探討甘油二酯激酶ζ(diacylglycerol kinaseζ,DGKζ)、蛋白激酶CβⅡ(protein kinase CβⅡ,PKCβⅡ)在不同毛色小鼠背部皮膚中的表達、定位及其與毛色形成的相關(guān)性。方法:1.通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)官網(wǎng),獲取人和小鼠DGKζ的序列;運用多種在線生物信息學(xué)分析平臺對人DGKζ在各器官組織中的表達及其轉(zhuǎn)錄因子、編碼產(chǎn)物的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位預(yù)測分析,并對人DGKζ的同源性進行分析;對小鼠DGKζ序列啟動子所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進行預(yù)測。2.取2M白、灰和黑色小鼠各6只,去毛取背部皮膚,行Real-time PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)ABC法染色技術(shù)檢測。結(jié)果:1.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:DGKζ在人體皮膚中表達;預(yù)測的人DGKζ啟動子可能結(jié)合的22個轉(zhuǎn)錄因子中ER-alpha、Sp1、p53、c-ets-1和YYY1這5個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細(xì)胞中表達;人DGKζ編碼產(chǎn)物不存在信號肽剪切位點屬非分泌蛋白,無跨膜區(qū)域;主要定位于細(xì)胞核,亦定位在細(xì)胞質(zhì);人與黑猩猩、馬、貓、灰倉鼠、牛、豚鼠、野豬、大鼠、小鼠和雞DGKζ的氨基酸同源性分別為99.8%、98.3%、97.7%、96.6%、96.6%、96.4%、96.3%、96.0%、96.0%、94.6%和78.6%,系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩親緣關(guān)系最近,與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。預(yù)測的小鼠DGKζ啟動子可能結(jié)合的13個轉(zhuǎn)錄因子中ER-alpha、p53和YYY1這3個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細(xì)胞中表達。2.Real-time PCR檢測顯示,DGKζ、PKCβⅡ在三種毛色小鼠背部皮膚中mRNA表達趨勢一致,均為:灰色組白色組;黑色組白色組,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Western blotting檢測表明,顯示PKCβⅡ活性的p-PKCβⅡ/PKCβⅡ,其變化趨勢與DGKζ在三種毛色小鼠背部皮膚中表達趨勢一致:灰色組白色組;黑色組白色組,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);免疫組織化學(xué)ABC法染色檢測顯示,DGKζ和p-PKCβⅡ在灰色和黑色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層及黑素細(xì)胞、毛囊的外根鞘、毛母質(zhì)細(xì)胞及毛母質(zhì)的黑素細(xì)胞呈陽性表達,而在白色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層、毛囊的外根鞘、毛母質(zhì)細(xì)胞及毛母質(zhì)的黑素細(xì)胞呈陰性表達。結(jié)論:1.運用生物信息學(xué)分析預(yù)測表明,DGKζ可能在人黑素細(xì)胞中表達且在哺乳動物間保守性較高;DGKζ可能也在小鼠黑素細(xì)胞中表達。2.綜合DGKζ、PKCβⅡ在灰色與白色、黑色與白色小鼠背部皮膚中的mRNA和蛋白表達水平的差異,以及DGKζ、p-PKCβⅡ在三種毛色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層及黑素細(xì)胞定位、毛球毛母質(zhì)細(xì)胞及黑素細(xì)胞定位,提示DGKζ、PKCβⅡ可能與皮膚色素沉著及毛色形成具有相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R394
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文112結(jié)果2.1人和小鼠DGKδ的生物信息學(xué)分析2.1.1人DGKζ在各組織中的表達水平分析通過NCBI檢索分析得到DGKδ在各組織中的表達水平（圖1）。DGKζ在多種器官組織中有表達，在腦中表達量最高：24.732±10.369，在肝臟中表達量最低：0.867±0.181，在皮膚中的表達量為4.555±2.711。圖1人DGKζ在各器官組織中的表達水平2.1.2人DGKζ轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測通過PROMO對人DGKζ啟動子預(yù)測，得到23個可能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的位點，轉(zhuǎn)錄因子包括：ER-alpha、C/EBPbeta、GR-alpha、Pax-5、p53、GR-beta、YY1、IRF-2、GATA-1、PRB、PRA、TCF-4E、FOXP3、c-ETS-1、AP-2alphaA、TFll-l、WT1、ETF、ENKTF-1、Sp1、RXR-alpha、STAT4、Elk-1。通過對以上轉(zhuǎn)錄因子進行文獻檢索，查閱到下列5個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細(xì)胞中表達：ER-alpha、Sp1、p53、c-ETS-1、YY1（圖2）。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文12圖2人DGKζ轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測2.1.3人DGKδ信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測運用SignalP-5.0服務(wù)平臺預(yù)測人DGKδ的潛在信號肽剪切位點，結(jié)果顯示，不存在可能的信號肽裂解位點（圖3），表明人DGKδ屬于非分泌蛋白。運用TMHMM2.0Server對人DGKδ的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測（圖4）。由跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析圖可以看到，DGKδ無跨膜結(jié)構(gòu)域，因此不可能是膜上的受體或定位于膜上。圖3人DGKδ信號肽預(yù)測

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文13圖4人DGKδ跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測2.1.4人DGKδ亞細(xì)胞定位的預(yù)測亞細(xì)胞定位的預(yù)測一般是通過算法進行比較檢索序列中包含的特征參數(shù)與各類相應(yīng)的亞細(xì)胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式做出判斷。通過PSORT平臺預(yù)測人DGKδ蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，其分布在細(xì)胞核（nuclear）的可能性為78.30%，分布在細(xì)胞質(zhì)（cytoplasmic）的可能性為13.00%，分布于線粒體（mitochondrial）的可能性為8.70%（圖5）。圖5人DGKδ亞細(xì)胞定位78.30%13.00%8.70%細(xì)胞核（nuclear）細(xì)胞質(zhì)（cytoplasmic）線粒體（mitochondrial）
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本文編號：2870854