復制起始識別復合體6(Orc6)是與DNA復制起始有關的蛋白質,是復制起始識別復合體(ORC)中唯一與AAA+ATP酶無關的亞基,對真核生物DNA復制起始發(fā)揮著重要作用。目前除DNA復制以外,Orc6還在異染色質形成、紡錘體組裝等方面發(fā)揮作用,然而到目前為止,其在早期胚胎發(fā)育過程中的作用尚不明確。本實驗通過RNAi技術研究Orc6基因的在早期胚胎發(fā)育過程中的作用,研究發(fā)現(xiàn)Orc6基因敲除的純合胚胎致死。然后通過RNAi技術構建敲低模型,以獲得充足的胚胎研究Orc6在小鼠植入前早期胚胎發(fā)育過程中的作用。1.Orc6~(-/-)胚胎表型分析通過取E7.5和E3.5的后代進行表型分析,我們發(fā)現(xiàn)E 7.5的胚胎基因型比例失調,但E3.5胚胎的基因型比例符合孟德爾遺傳定律,推測Orc6~(-/-)胚胎的死亡時間在E3.5-E7.5之間,接著對E3.5胚胎進行Outgrowth培養(yǎng),純合胚胎沒有突破透明帶。2.Orc6 mRNA在植入前早期胚胎中的表達利用定量PCR技術對Orc6在卵母細胞以及早期胚胎的表達分析,發(fā)現(xiàn)Orc6的表達在胚胎發(fā)育的各個時期并無規(guī)律可循。從卵母細胞至受精卵階段Orc6 mRNA的表達量顯著增加,2-cell期下降,4-cell和8-cell期表達量增加,桑葚胚期的表達逐漸下降,到囊胚期表達量到達最低。3.Orc6基因沉默對植入前早期胚胎發(fā)育的影響胞漿注射Orc6 siRNA建立胚胎敲低模型,通過免疫熒光、定量PCR等技術,了解Orc6對小鼠胚胎發(fā)育第一、二次譜系分化的影響,以及Orc6基因缺失對細胞凋亡以及紡錘體組裝的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)Orc6會通過影響PrE細胞命運決定的調節(jié)因子Sox17的表達,來影響PrE細胞命運分配。除此以外,Orc6基因沉默會導致胚胎出現(xiàn)無法修復的DNA損傷,但Orc6基因沉默并不影響紡錘體組裝。綜上,Orc6基因沉默影響PrE細胞的命運分配,且導致不可修復的DNA損傷,但對紡錘體的正確組裝沒有影響。通過實驗,我們對Orc6基因功能有了進一步的了解,為胚胎發(fā)育第二譜系分化的研究提供了新的思路。
【學位單位】：阜陽師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：Q132.4
【部分圖文】：

阜陽師范大學碩士學位論文3圖1.1內外模型[18]Fig1.1TheInside–OutsideModel[18]1.3.1.2細胞極性模型（TheCellPolarityModel）細胞極性模型是根據(jù)卵裂方向以及細胞極性導致的細胞位置決定的，即卵裂球在胚胎內獲得的位置是由其分裂方向決定的。如果8到16細胞階段，卵裂球的有絲分裂紡錘體的方向垂直于頂端-基底外側軸，則分裂方向與其平行，卵裂球細胞被分裂形成的兩個子細胞，這兩個子細胞都繼承頂端區(qū)和基底外側的成分，這種“對稱分裂”產(chǎn)生的兩個相同的子細胞在大多數(shù)情況下都將保持極化狀態(tài)并位于胚胎的外部位置。如果有絲分裂平行于頂端-基底外側軸，則產(chǎn)生的分裂平面垂直于該軸，這種分裂模式產(chǎn)生了兩個不同的子細胞，一個子細胞擁有親代的頂端區(qū)，保持極化狀態(tài)位于胚胎外部；而另一個則擁有了親代細胞基底外側區(qū)域，變?yōu)榉菢O性，位于胚胎內部[19]。然而這個想法是根據(jù)沒有直接觀察完整胚胎的分離的卵裂球結果提出的，與胚胎的不對稱分裂的方向具有一定的相關性，除了平行或垂直于頂端-基地外側膜兩種分裂方式以外，還出現(xiàn)傾斜分裂的現(xiàn)象[20,21]。這種傾斜的分裂使頂端區(qū)在子代細胞之間不均勻分配，并且兩者均占據(jù)胚胎外部位置，這種極性的不對稱分布導致了極化程度較低的外部細胞內部化[22]，這種內化過程主要是由外部的少極化細胞非接觸表面的表

第1章引言4面收縮力增加導致的，這種表面收縮力主要是由磷酸化的肌球蛋白Ⅱ在起作用。用肌球蛋白抑制劑Blebistin阻斷肌球蛋白的收縮性，會阻止少極性的外部細胞發(fā)生內化。磷酸化的肌球蛋白在非極性外部細胞的非接觸區(qū)積累，負責誘導非極性外部細胞內部化，但同時頂端蛋白在極性部位會對抗這種肌動球蛋白的收縮以防止其內部化[22]（圖1.2）。圖1.2極性模型[18]Fig1.2TheCellPolarityModel[18]1.3.2影響譜系分化的基因和信號通路1.3.2.1Cdx2Cdx2是TE細胞的標記基因之一，在TE形成過程中，Cdx2是TE發(fā)育所必需的同源盒轉錄因子，Cdx2敲除胚胎因為無法形成成熟的TE而導致植入失敗，并且滋養(yǎng)層的缺失會導致胚胎無法擴大成腔。除此之外，Cdx2基因缺失的胚胎中，ICM的特異性轉錄因子Oct4和Nanog在TE中表達，表明CDX2是抑制TE中Oct4和Nanog表達所必須[23]。從在8細胞階段開始，CDX2與OCT4和NANOG在整個胚胎的全部卵裂球中相對均勻的表達，直到囊胚中期和晚期才逐漸在TE細胞中特異性表達[24,25]（圖1.3B）。在內外細胞以及囊胚的形成過程中，CDX2首先在TE中特異性表達，隨后OCT4在ICM中特異性表達[26]。除了相互抑制以外，胚胎中還存在連接細胞位置與Cdx2表達的關鍵信號通路Hippo信號通路。該通路最初在果蠅中被確認為是控制器官大小的信號通路[27,28]，并且在哺乳動物中保守，并被用來調節(jié)細胞增殖、凋亡以及干細胞維持等。

第1章引言641]。Hippo信號通路在空間上的差異性的激活確保了只有外部細胞才能表達滋養(yǎng)外胚層基因Cdx2，而內部細胞由于不會向滋養(yǎng)外胚層細胞命運決定做出任何貢獻，因此不適當?shù)募せ罨蜣D錄會被阻止（圖1.3C）[42]。圖1.3TE和ICM細胞命運決定的分子機制[43]Fig1.3MolecularmechanismforthespecificationofTEandICMfates[43]在依據(jù)細胞位置調節(jié)Hippo信號通路的過程中，血管動蛋白（Angiomotin，AMOT）發(fā)揮了作用[44,45]，AMOT位于LAST激酶發(fā)上游，是Lats1/2激酶的激活因子，首次在8細胞期胚胎的極膜區(qū)有較低表達；但從16細胞開始，AMOT在內外細胞的定位有了顯著的變化，雖然AMOT定位于內部細胞的整個細胞膜，但在外部細胞，AMOT只定位在頂端區(qū)[45]。正是這種在空間上完全不同的內部/非極性細胞和外部/極性細胞之間的蛋白分布的差異，對建立、驅動第一個細胞命運決定的Hippo信號通路的激活至關重
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本文編號：2868094