天然木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以降解,微生物協(xié)同降解木質(zhì)素機(jī)制尚不完全清楚。為明確木質(zhì)素降解復(fù)合菌系在不同時(shí)期的微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律,探究微生物降解木質(zhì)素的協(xié)同作用關(guān)系。我們?nèi)?fù)合菌系的種子液和木質(zhì)素降解初期、高峰期與末期樣品,對(duì)其樣品進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序;取復(fù)合菌系木質(zhì)素降解初期和高峰期樣品,對(duì)其樣品進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序。以期從DNA和RNA層面共同闡釋復(fù)合菌系的協(xié)同降解作用關(guān)系,解析微生物菌群在降解木質(zhì)素過(guò)程中的貢獻(xiàn)。基于16S rRNA基因注釋微生物多樣性發(fā)現(xiàn),種子液中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Pseudomonas(28.24%)、Ruminofilibacter(26.87%)、Sphaerochaeta(19.47%)、Caenispirillum(7.97%)、Mangroviflexus(2.52%);降解初期的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Pseudomonas(22.08%)、Thauera(5.38%)、Pannonibacter(6.60%)、Anaerocolumna(6.47%)、Sphaerochaeta(5.57%)、Caenispirillum(5.52%)、Proteiniphilum(4.68%);降解高峰期的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Anaerocolumna(44.78%)、Pseudomonas(20.93%)、Sphaerochaeta(5.57%)、Caenispirillum(5.52%)、Ruminofilibacter(4.10%)、Paenibacillus(3.81%)、Thauera(3.65%);在降解末期的優(yōu)勢(shì)菌屬為Ruminofilibacter(22.76%)、Sphaerochaeta(17.29%)、Pseudomonas(12.55%)、Caenispirillum(8.95%)、Mangroviflexus(7.49%)、Azospirillum(6.50%)、Thauera(2.19%)�；诤贽D(zhuǎn)錄組學(xué)注釋微生物多樣性發(fā)現(xiàn),復(fù)合菌系中的轉(zhuǎn)錄本信息主要來(lái)源于Clostridium(21.62%-49.35%)、Lachnoclostridium(17.11%-19.40%)、Cellulosilyticum(3.96%-10.84%)、Thermoanaerobacterium(1.08%-7.99%)、Herbinix(3.17%-3.76%)、Bacillus(2.89%-3.34%)、Proteiniphilum(1.00%-3.41%)�；�16S rRNA基因注釋方法和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析,發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)方式下共同擁有的細(xì)菌屬有28個(gè),后者檢測(cè)到的微生物種類(lèi)更豐富。利用四種常用蛋白功能數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)復(fù)合菌系的功能和代謝特征注釋,發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系中微生物的功能主要集中在碳水化合物代謝和氨基酸代謝,表明了復(fù)合菌系含有大量與碳水化合物相關(guān)的酶基因以及功能微生物。利用CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步對(duì)復(fù)合菌系中的木質(zhì)纖維素酶基因進(jìn)行注釋分析。發(fā)現(xiàn)編碼木質(zhì)素降解酶的有6個(gè)AAs家族基因,編碼纖維素降解酶的有7個(gè)GHs和2個(gè)CEs家族基因,編碼半纖維素降解酶的有12個(gè)GHs和4個(gè)CEs家族基因,編碼寡糖降解酶的有34個(gè)GHs家族基因,以及具有能夠結(jié)合底物從而起到輔助降解作用的27個(gè)CBMs家族基因,共有27種微生物編碼這些酶基因,推測(cè)出復(fù)合菌系主要以解聚木質(zhì)素本體的酚氧化途徑和降解小分子化合物的非酚氧化途徑即為芬頓反應(yīng)以及對(duì)半纖維素類(lèi)雜多糖的水解來(lái)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的高效降解。分析以上結(jié)果可知,在降解木質(zhì)素過(guò)程中,不同降解時(shí)期復(fù)合菌系群落結(jié)構(gòu)、功能和代謝特征變化顯著。碳水化合物代謝相關(guān)的基因在復(fù)合菌系中轉(zhuǎn)錄活躍。根據(jù)獲得的復(fù)合菌系降解木質(zhì)素的功能酶基因以及編碼的功能微生物,化抽象為具體,構(gòu)建出復(fù)合菌系對(duì)木質(zhì)素高效降解模型,揭示了復(fù)合菌系高效降解木質(zhì)素的協(xié)同作用關(guān)系,為細(xì)菌復(fù)合菌系的木質(zhì)素高效降解機(jī)制提供理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支撐。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：Q933
【部分圖文】：

常溫細(xì)菌復(fù)合菌系降解木質(zhì)素的協(xié)同作用解析2圖1-1木質(zhì)素結(jié)構(gòu)Fig.1-1Structureoflignin雖然木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)已被廣泛研究，但由于其復(fù)雜和不規(guī)則的基質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致木質(zhì)素很難被直接利用。目前世界各地的研究團(tuán)體已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種使用化學(xué)、機(jī)械、物理和生物學(xué)方法，從木質(zhì)纖維素網(wǎng)絡(luò)中將木質(zhì)素分離和利用木質(zhì)素。隨著近年來(lái)關(guān)于木質(zhì)素增值和預(yù)處理方法開(kāi)發(fā)[13,14]，與其他方法相比，生物學(xué)方法在經(jīng)濟(jì)和環(huán)保方面有很大優(yōu)勢(shì)，也符合中國(guó)當(dāng)前的可持續(xù)發(fā)展國(guó)情[15]。1.2.2木質(zhì)素降解微生物的研究進(jìn)展1.2.2.1木質(zhì)素降解真菌的研究進(jìn)展目前研究較多的白腐菌有：黃孢原毛平革菌、射脈菌、變色栓菌、蟲(chóng)擬蠟菌、煙管菌等[16]。其中，黃孢原毛平革菌更是由于突出的木質(zhì)素降解能力，而成為真菌降解木質(zhì)素研究的模式菌株[17]。真菌在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇、農(nóng)副產(chǎn)品的生物轉(zhuǎn)化和生物漂白等方面得到廣泛應(yīng)用[18,19]。雖然真菌在木質(zhì)素的分解中比細(xì)菌中更有效，但其脫木素化慢且有限[20]。Arimoto等[21]過(guò)表達(dá)了密粘褶菌KU-4的一種內(nèi)源酶，使乙醇的產(chǎn)量提高了45%，木質(zhì)素的降解能力大幅提升。Kneevi等[22]發(fā)現(xiàn)氨基苯甲醚能提高毛栓白腐菌對(duì)木質(zhì)素的選擇性。在生態(tài)系統(tǒng)中，木質(zhì)素降解真菌大多以腐生菌或弱寄生物的形式存在。然而真菌，尤其是曲霉類(lèi)真菌具有一定的潛在致病性，其孢子易傳播、污染，發(fā)酵液具有刺激性氣味等弊端。1.2.2.2木質(zhì)素降解細(xì)菌的研究進(jìn)展細(xì)菌這種無(wú)處不在的微生物群體廣泛分布于全球的自然生態(tài)系統(tǒng)中。木質(zhì)素降解細(xì)菌也廣泛存在白蟻腸道、牛胃等生境中，如芽孢桿菌屬等[23-26]，其主要是通過(guò)產(chǎn)生次生代謝物和細(xì)胞外酶對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行分解[27,28]。Paliwal等[29]從造紙廢水污染的土壤中分離出巨大芽孢桿菌和假單胞菌能夠促進(jìn)造紙黑液中的木質(zhì)素

結(jié)果與分析133結(jié)果與分析3.1木質(zhì)素降解復(fù)合菌系的降解特性3.1.1復(fù)合菌系在降解水稻秸稈過(guò)程中生長(zhǎng)量的變化分析從接菌開(kāi)始計(jì)時(shí)，在無(wú)菌條件下按照試驗(yàn)計(jì)劃取樣。測(cè)定此時(shí)復(fù)合菌系在600nm波長(zhǎng)下的吸光度值，從而來(lái)檢測(cè)復(fù)合菌系在降解木質(zhì)素過(guò)程中生長(zhǎng)量變化情況。如圖3-1所示，隨著木質(zhì)素的降解，復(fù)合菌系的OD值變化趨勢(shì)為先迅速升高，經(jīng)過(guò)緩慢升高后到達(dá)最高點(diǎn)，隨后開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。此變化趨勢(shì)反映出了微生物生長(zhǎng)的4個(gè)不同時(shí)期。復(fù)合菌菌系在培養(yǎng)的前12h里，OD值有所增長(zhǎng)至0.16。在第1d-2d時(shí)間里，OD值迅速增長(zhǎng)，從0.23增長(zhǎng)至0.67，在此時(shí)間段內(nèi)木質(zhì)素被快速降解。從第2d之后，OD值緩慢增長(zhǎng)直到第5d達(dá)到頂峰進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，此時(shí)OD值為0.95。從第5d開(kāi)始之后，OD值開(kāi)始下降，此后水稻秸稈幾乎不再被降解，到第7d培養(yǎng)結(jié)束，此時(shí)復(fù)合菌系的OD值為0.69。根據(jù)以上數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系在不同降解時(shí)期均有較高的代謝活性，為后續(xù)高通量測(cè)序所需DNA量和RNA量的充足得到保證。圖3-1復(fù)合菌系生長(zhǎng)量變化情況Fig.3-1Thegrowthchangeofconsortium.3.1.2復(fù)合菌系在降解水稻秸稈過(guò)程中體系pH的變化分析從接菌開(kāi)始計(jì)時(shí)，在無(wú)菌條件下按照試驗(yàn)計(jì)劃取樣。測(cè)定復(fù)合菌系在降解木質(zhì)素過(guò)程中體系的pH變化趨勢(shì)，如圖3-2所示。隨著木質(zhì)素的降解，復(fù)合菌系的pH值變化趨勢(shì)呈現(xiàn)為先迅速下降，之后緩慢回升，最后趨于中性。接種后體系的初始pH為7.73，隨著木質(zhì)素的降解，體系的pH在前2d時(shí)快速下降，到第2d下降到最低點(diǎn)，此時(shí)pH為6.56。

復(fù)合菌系培養(yǎng)體系pH變化情況
【參考文獻(xiàn)】

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