發(fā)布時間：2020-10-31 15:07

　　 生物體生理和病理的變化機制研究對預(yù)防和診斷疾病至關(guān)重要。細胞作為生物體基本的結(jié)構(gòu)和功能單位,參與生物體內(nèi)各種生理過程與變化。監(jiān)測細胞內(nèi)各種活性物質(zhì)的種類、形成過程和細胞內(nèi)微環(huán)境的變化,是研究生理和病理變化機制的基礎(chǔ)。但是,由于細胞內(nèi)分析物的濃度相對較低,因此迫切需要高靈敏度的新型成像工具。傳統(tǒng)的成像方式,如計算機斷層掃描,磁共振成像和超聲檢查等,缺乏足夠的特異性和敏感性。正電子發(fā)射斷層掃描靈敏度高,但是這種成像方式受限于嚴格的放射性化合物使用規(guī)定。而光學(xué)成像以其無創(chuàng)、實時和高分辨率成像為準確診斷疾病提供了希望。特別是利用小分子熒光技術(shù)進行的定位成像,實現(xiàn)了可視化細胞中的特定細胞器乃至整個活細胞,同時也成為了準確預(yù)防診斷疾病的有力工具。(1)利用細胞器物理性質(zhì)監(jiān)測脂滴的形成過程極性是生命體中的一個重要理化性質(zhì),在細胞生理過程的變化中發(fā)揮著重要作用。相比蛋白質(zhì)、核酸和碳水化合物等,脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的極性相對較小。而極性敏感型熒光探針分子可以很好地定位脂質(zhì)物質(zhì)。極性敏感型熒光探針在電子激發(fā)后,偶極矩會發(fā)生明顯變化,影響發(fā)射波長的位移。通過收集不同波段的光,可以精確的定位不同極性的細胞器。(2)熒光分子與特異性靶向蛋白共價結(jié)合實現(xiàn)細胞器的定位成像實現(xiàn)活細胞內(nèi)對特定蛋白質(zhì)的實時動態(tài)分析是科學(xué)家一直探索的問題之一。SNAP-tag無論在體內(nèi)還是體外都可以通過共價鍵與苯甲基鳥嘌呤衍生物發(fā)生快速特異性反應(yīng)。當我們利用基因工程在某一細胞器上融合表達SNAP-tag蛋白,通過熒光探針與SNAP-tag蛋白的特異性結(jié)合就可以間接將熒光分子緊緊的帶入特定的細胞器上,實現(xiàn)細胞器的定位與可視化。(2)基于酶切反應(yīng)調(diào)控?zé)晒庑盘枌崿F(xiàn)特異性識別腫瘤蛋白酶作為許多疾病的重要診斷生物標志物,在調(diào)節(jié)各種代謝過程中起重要作用。體內(nèi)監(jiān)測蛋白酶對于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究至關(guān)重要,特別是在腫瘤中。γ-谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(GGT)是在實體瘤中過度表達的最重要的蛋白酶之一。所以準確識別GGT可以精準定位腫瘤。探針由熒光分子通過酰胺鍵與特定的識別基團相連,不發(fā)熒光。但當過量GGT存在的條件下,識別基團可以特異性與GGT反應(yīng),切斷酰胺鍵,水解去除底物肽鏈,釋放出熒光分子,發(fā)出熒光,實現(xiàn)實時、精準的定位腫瘤組織。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R318;O657.3
【部分圖文】：

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文4Tang及其同事開發(fā)了一種由四苯乙烯（Tetraphenylethene，TPE）和花青（Cyanine，Cy）單元組成的pH比例型探針（TPE-Cy）[22]。該pH探針隨著介質(zhì)逐漸酸化，489nm處的藍光發(fā)射減弱，615nm處的紅光發(fā)射出現(xiàn)并增強。因此，藍色熒光強度與紅色熒光強度之比反映了介質(zhì)pH值。根據(jù)共聚焦圖像中藍色信號與紅色信號比的分布圖，可獲得HeLa細胞微環(huán)境的pH值。圖1-1：a為TPE-Cy的結(jié)構(gòu)式，b、c為HeLa細胞共聚焦圖像中藍紅光發(fā)射比的分布[22]。（2）通過細胞內(nèi)微環(huán)境粘度差異實現(xiàn)定位細胞內(nèi)粘度在調(diào)節(jié)信號分子以及短壽命中間體（如活性氮（reactivenitrogenspecies，RNS）和活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS））等的擴散（例如ONOO·及其質(zhì)子形式的過氧亞硝酸（HOONO）、超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥自由基等）中起著至關(guān)重要的作用[23,24]。細胞內(nèi)粘度異常與一系列功能和疾病有關(guān)，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、動脈粥樣硬化、糖尿病等。因此，實現(xiàn)細胞內(nèi)微環(huán)境粘度的定位成像將有助于疾病的診斷[21]。Bottari及其同事報道了一種高度敏感的細胞內(nèi)粘度探針4-（三苯氨基）-鄰苯二甲腈（4-(triphenylamino)-phthalonitrile，TPAP）[25]。隨著溶劑粘度的增加，TPAP的旋轉(zhuǎn)逐漸受到限制，熒光強度和壽命得到延長。其旋轉(zhuǎn)動力學(xué)受局部粘度調(diào)節(jié)，并通過可變光譜信號顯示出來。如圖所示，倉鼠卵巢細胞（Chinesehamsterovarycell，CHO）中可觀察到強烈的熒光信號。基于探針的熒光強度表明，囊泡的粘度（由白色箭頭指示的區(qū)域）高于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的粘度（紫色箭頭）。此

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文5外，該探針還可以感應(yīng)到核（紅色箭頭）和質(zhì)膜（黃色箭頭）的粘度，兩者均顯示暗淡的熒光。圖1-2：（a）為TPAP的結(jié)構(gòu)式，（b、c）為CHO細胞成像圖并通過TPAP檢測細胞內(nèi)粘度。比例尺：（b）10μm，（c）5μm[25]。（3）通過細胞內(nèi)微環(huán)境的極性差異實現(xiàn)定位極性也是細胞微環(huán)境一個重要的物理性質(zhì)。細胞極性對于許多生物學(xué)過程至關(guān)重要，例如，細胞運動遷移就依賴于細胞的極性化。同時，各細胞器之間極性的差異也是用于區(qū)分定位各個細胞器重要的依據(jù)。脂滴（Lipiddroplets，LDs）作為一種公認的非極性細胞器，其過度形成導(dǎo)致了肥胖癥的出現(xiàn)[21,26]。利用高靈敏度的環(huán)境敏感性極性探針實現(xiàn)對LDs的定位成像至關(guān)重要。尼羅紅（Nilered）是一種商業(yè)化的溶劑化變色染料，作為一種敏感的極性探針可對LDs進行染色。Greenspan等發(fā)現(xiàn)尼羅紅可實現(xiàn)LDs的可視化，并且不會溶解脂質(zhì)[27]。圖1-3為在尼羅紅作用下的LDs定位成像圖。圖1-3：a為尼羅紅結(jié)構(gòu)式。（b和c）尼羅紅孵育后主動脈平滑肌細胞的共聚焦圖片。（d和e）尼羅紅孵育后腹膜巨噬細胞的共聚焦圖片。（b和d）λex=450-550nm處，λem>528nm；（c和e）λex=515-560nm處，λem>590nm[27]。

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文5外，該探針還可以感應(yīng)到核（紅色箭頭）和質(zhì)膜（黃色箭頭）的粘度，兩者均顯示暗淡的熒光。圖1-2：（a）為TPAP的結(jié)構(gòu)式，（b、c）為CHO細胞成像圖并通過TPAP檢測細胞內(nèi)粘度。比例尺：（b）10μm，（c）5μm[25]。（3）通過細胞內(nèi)微環(huán)境的極性差異實現(xiàn)定位極性也是細胞微環(huán)境一個重要的物理性質(zhì)。細胞極性對于許多生物學(xué)過程至關(guān)重要，例如，細胞運動遷移就依賴于細胞的極性化。同時，各細胞器之間極性的差異也是用于區(qū)分定位各個細胞器重要的依據(jù)。脂滴（Lipiddroplets，LDs）作為一種公認的非極性細胞器，其過度形成導(dǎo)致了肥胖癥的出現(xiàn)[21,26]。利用高靈敏度的環(huán)境敏感性極性探針實現(xiàn)對LDs的定位成像至關(guān)重要。尼羅紅（Nilered）是一種商業(yè)化的溶劑化變色染料，作為一種敏感的極性探針可對LDs進行染色。Greenspan等發(fā)現(xiàn)尼羅紅可實現(xiàn)LDs的可視化，并且不會溶解脂質(zhì)[27]。圖1-3為在尼羅紅作用下的LDs定位成像圖。圖1-3：a為尼羅紅結(jié)構(gòu)式。（b和c）尼羅紅孵育后主動脈平滑肌細胞的共聚焦圖片。（d和e）尼羅紅孵育后腹膜巨噬細胞的共聚焦圖片。（b和d）λex=450-550nm處，λem>528nm；（c和e）λex=515-560nm處，λem>590nm[27]。
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本文編號：2864111