發(fā)布時間：2020-10-23 16:45

　　 本文以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對象,在小瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,對MCF-7進(jìn)行規(guī)模放大培養(yǎng),建立了MCF-7的滾瓶培養(yǎng)方法,然后研究了軟骨多糖對MCF-7的誘導(dǎo)凋亡作用及其作用機理。本研究首先以滾瓶轉(zhuǎn)速為變量,通過單因素試驗確定了MCF-7滾瓶培養(yǎng)的滾瓶初期轉(zhuǎn)速范圍和貼壁后轉(zhuǎn)速范圍。然后以接種量、培養(yǎng)液添加量和培養(yǎng)時間為自變量,進(jìn)行了三因素三水平的正交試驗,通過分析得出對細(xì)胞產(chǎn)量影響極顯著的因素為接種量和培養(yǎng)時間,根據(jù)正交試驗的結(jié)果確定了滾瓶培養(yǎng)MCF-7的最佳方案為初期轉(zhuǎn)速15r/h,貼壁后轉(zhuǎn)速40r/h,接種量為5×107個細(xì)胞,培養(yǎng)時間96h,培養(yǎng)基用量150mL。在確立了MCF-7的滾瓶培養(yǎng)方法后,研究了軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用。Hochest33342/PI雙染色、Annexin V-FITC/PI 和 DNA Ladder等實驗結(jié)果都表明MCF-7細(xì)胞在軟骨多糖作用后出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)在軟骨多糖作用12h,24h的MCF-7凋亡率分別為20.23%和44.7%；同時發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞在軟骨多糖作用后,細(xì)胞周期被阻滯在了S期。通過二維電泳技術(shù)分析了正常MCF-7細(xì)胞和與軟骨多糖共培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞的全蛋白圖譜,發(fā)現(xiàn)10個具有表達(dá)差異的蛋白點,其中7個蛋白點的表達(dá)量下調(diào),3個蛋白點表達(dá)量上調(diào)。選取其中表達(dá)差異最顯著的3個蛋白點,通過MALDI-TOF-MS/MS進(jìn)行鑒定,共鑒定出2個差異表達(dá)蛋白,其中一個為肌動蛋白actin,其表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑,另一個為抗氧化類蛋白PRDX6,其表達(dá)降低,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷凋亡。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q813;R737.9
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用
        1.1.1 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述
        1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在抗腫瘤研究中的應(yīng)用
    1.2 乳腺癌概述
        1.2.1 乳腺癌發(fā)展及現(xiàn)狀
        1.2.2 乳腺癌的發(fā)病機制及治療
    1.3 多糖概述
        1.3.1 多糖的分類
        1.3.2 多糖的活性
    1.4 細(xì)胞凋亡概述
        1.4.1 細(xì)胞凋亡的特征
        1.4.2 細(xì)胞凋亡的作用機理及調(diào)控
        1.4.3 研究細(xì)胞凋亡應(yīng)用于乳腺癌治療的展望
    1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用
        1.5.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念
        1.5.2 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)及在細(xì)胞調(diào)亡研究中的應(yīng)用
    1.6 本課題的研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要試劑及藥品
        2.1.2 實驗儀器與設(shè)備
        2.1.3 實驗細(xì)胞及軟骨多糖制備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 MCF-7細(xì)胞系的維持
        2.2.2 MCF-7細(xì)胞滾瓶培養(yǎng)條件的研究
        2.2.3 MCF-7細(xì)胞與軟骨多糖在滾瓶中共培養(yǎng)
        2.2.4 轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞觀察臺對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的觀察
        2.2.5 Hoechst33342/PI雙染檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7的凋亡作用
        2.2.6 Annexin V-FITC/PI染檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)MCF-7的凋亡作用
        2.2.7 DNA Ladder法檢測軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7的凋亡作用
        2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)分析軟骨多糖對滾瓶培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞周期的影響
        2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）比較MCF-7蛋白差異
        2.2.10 利用雙向電泳結(jié)合MALDI-TOF分析MCF-7凋亡前后差異蛋白
3 結(jié)果與討論
    3.1 MCF-7細(xì)胞的滾瓶培養(yǎng)條件
        3.1.1 轉(zhuǎn)速范圍
        3.1.2 培養(yǎng)時間
        3.1.3 培養(yǎng)液用量
        3.1.4 正交法優(yōu)化培養(yǎng)條件
    3.2 轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞觀察臺觀察軟骨多糖對MCF-7的作用
    3.3 Hoechst33342/PI雙染色檢測MCF-7的凋亡作用
    3.4 Annexin V FITC-PI對MCF-7的凋亡檢測結(jié)果
    3.5 凋亡細(xì)胞DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
    3.6 流式細(xì)胞術(shù)測定MCF-7細(xì)胞周期結(jié)果
    3.7 SDS-PAGE分析MCF-7凋亡前后蛋白
    3.8 二維電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS/MS分析結(jié)果
        3.8.1 二維電泳結(jié)果
        3.8.2 差異表達(dá)蛋白MADI-TOF-MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果
4 結(jié)論
5 展望
6 參考文獻(xiàn)
7 致謝

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 魏欣;MCF-7的滾瓶培養(yǎng)及軟骨多糖誘導(dǎo)其凋亡的作用研究[D];天津科技大學(xué);2015年

本文編號：2853284