目的:Lhx8基因?qū)τ谀憠A能和GABA能神經(jīng)元的發(fā)生分化發(fā)育有重要作用,但其在新生鼠神經(jīng)元發(fā)育中的作用尚不明確,尤其是Lhx8基因?qū)τ贕ABA能神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用尚未得到一致的認(rèn)同,基于此,本實(shí)驗(yàn)采用包含有Tet-on系統(tǒng)的慢病毒來(lái)調(diào)控Lhx8的表達(dá),研究過(guò)表達(dá)Lhx8對(duì)于新生大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元的影響。方法:從Gene Bank中調(diào)取Rattus norvegicus Lhx8(rLhx8)序列,上游加入Kozak序列,人工合成全序列,鏈接入pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo質(zhì)粒產(chǎn)生載體質(zhì)粒pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo,對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定和擴(kuò)增;使用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,并使用293T細(xì)胞檢測(cè)其感染能力;將獲得的含有大鼠Lhx8(rLhx8)的慢病毒及其相應(yīng)對(duì)照慢病毒對(duì)新生大鼠進(jìn)行腦室注射,給予0.5mg/ml四環(huán)素誘導(dǎo)rLhx8的表達(dá),在注射病毒48h,72h和96h后,每只新生大鼠取左側(cè)海馬提取RNA,右側(cè)海馬提取蛋白質(zhì),通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)新生大鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元表面標(biāo)志物(Choline Acetyltransferase,CHAT)和GABA能神經(jīng)元表面標(biāo)志物(Glutamic Acid Decarboxylases 65,GAD65)表達(dá)的變化,取全腦制備石蠟切片,利用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)CHAT和GAD65的表達(dá),利用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果,每只大鼠選擇4張切片,每張切片選擇4個(gè)視野觀察拍照,所獲得的圖片經(jīng)過(guò)Ipwin檢測(cè)平均熒光密度,取平均值,經(jīng)過(guò)Graphpad來(lái)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值和方差計(jì)算,組間比較使用t檢驗(yàn),P0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:包裝質(zhì)粒(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)、載體質(zhì)粒(pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo)和調(diào)控質(zhì)粒(pLVX-Tet-On-Puro)鑒定成功后,對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,通過(guò)大提試劑盒可得到滿足實(shí)驗(yàn)需求的質(zhì)粒。pLP1,pLP2,pLP/VSVG,pLVX-Tet-On-Puro和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo五質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,可見(jiàn)綠色熒光,收集上清,離心沉淀獲得慢病毒,同時(shí)用其感染293T細(xì)胞,表明慢病毒具有感染能力。RT-PCR結(jié)果表明,誘導(dǎo)Lhx8基因過(guò)表達(dá)48h時(shí),各組間檢測(cè)指標(biāo)無(wú)差異;72h及96h時(shí),膽堿能神經(jīng)元表面標(biāo)志物CHAT增加,GABA能神經(jīng)元表面標(biāo)志物GAD65減少(P0.05,n=4),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新生大鼠海馬免疫熒光染色結(jié)果表明,慢病毒載體介導(dǎo)的外源Lxh8基因的過(guò)表達(dá),使新生大鼠海馬CHAT陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增加,使GAD65陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少,(P0.05,n=4),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果表明,慢病毒注射四環(huán)素誘導(dǎo)48h時(shí),實(shí)驗(yàn)組各組間沒(méi)有差異,72h及96h時(shí),GAD65的蛋白翻譯水平有降低,(P0.05,n=4),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:在新生大鼠海馬部,誘導(dǎo)Lhx8基因過(guò)表達(dá)72h及96h后能夠促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物CHAT表達(dá),抑制GABA能神經(jīng)元表面標(biāo)志物GAD65的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R338
【文章目錄】：
前言
摘要
Abstract
英文縮略詞
第1章 文獻(xiàn)綜述
第2章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制
    2.5 實(shí)驗(yàn)方法
        2.5.1 質(zhì)粒的獲得、鑒定及擴(kuò)增
        2.5.2 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        2.5.3 慢病毒包裝
        2.5.4 新生大鼠慢病毒腦室注射及取材
        2.5.5 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)慢病毒注射后新生大鼠海馬膽堿能及GABA能神經(jīng)元的表達(dá)水平
        2.5.6 Western Blot技術(shù)檢測(cè)慢病毒毒注射后新生大鼠海馬GABA能神經(jīng)元的蛋白表達(dá)水平
        2.5.7 CHAT及GAD65的免疫熒光染色
    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建擴(kuò)增及鑒定
        3.1.1 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo質(zhì)粒構(gòu)建
        3.1.2 pLP1，pLP/VSVG及pLVX-Tight-IRES-ZsGreen-Neo質(zhì)粒圖譜及鑒定
        3.1.3 pLP2質(zhì)粒圖譜及鑒定
        3.1.4 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo和pLVX--Tet-On-Puro質(zhì)粒圖譜及鑒定
    3.2 慢病毒包裝
    3.3 新生大鼠側(cè)腦室注射
    3.4 RT-PCR檢測(cè)組織中rLhx8、GAD65和CHAT的表達(dá)情況
    3.5 各組海馬組織中CHAT和GAD65的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
    3.6 Western blot檢測(cè)各組組織中GAD65的表達(dá)情況
第4章 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
研究生期間所取得的科研成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張莉;張孟玲;郭菲菲;孫向榮;高勝利;徐珞;;側(cè)腦室注射Orexins對(duì)大鼠攝食的影響及機(jī)制[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年01期

2 王思;李秀華;杜鵑;岳龍濤;王瑤;劉菲;郭配;;側(cè)腦室注射腺病毒介導(dǎo)的GDNF基因?qū)ε两鹕〉谋Ｗo(hù)作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2016年04期

3 李浩明;秦建兵;金國(guó)華;施金洪;鄒琳清;張新化;韓笑;丁會(huì);成翔;;慢病毒介導(dǎo)的Lhx8基因過(guò)表達(dá)在海馬膽堿能神經(jīng)元發(fā)生中所起作用的初步研究[J];南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年05期

4 李浩明;朱培培;金國(guó)華;施金洪;鄒琳清;田美玲;衣昕;秦建兵;;神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)海馬膽堿能神經(jīng)再生過(guò)程中Lhx8的動(dòng)態(tài)表達(dá)[J];解剖學(xué)報(bào);2014年04期

5 施金洪;金國(guó)華;李浩明;衣昕;秦建兵;田美玲;張新化;;Lhx8在海馬膽堿能神經(jīng)再生中的作用[J];解剖學(xué)報(bào);2013年06期

6 劉又銘;劉衛(wèi)平;;同源盒基因與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分化[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2010年03期

7 張濤;唐曉平;;Shh信號(hào)途徑在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中的作用[J];國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2009年01期

8 葉建新,王瑋,姚麗青;血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬膽堿能神經(jīng)元的變化[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2004年09期

9 王俊茹,覃文新,舒惠群,潘勇,張玉燕,萬(wàn)大方;四環(huán)素調(diào)控的真核表達(dá)體系Hep3B Tet-On細(xì)胞株的建立[J];腫瘤;2002年03期

10 趙偉東,陳譽(yù)華;LIM域結(jié)合蛋白研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2002年01期

本文編號(hào)：2836828