【摘要】：為研發(fā)針對我國牛支原體流行菌株更為有效、安全、穩(wěn)定的牛支原體病疫苗,本試驗對牛支原體NM2012株的基因遺傳穩(wěn)定性和奶牛致病性及免疫原性進(jìn)行了研究,并建立了檢測鼠抗牛支原體抗體的間接ELISA方法。根據(jù)GenBank上登錄的牛支原體NM2012株全基因組序列設(shè)計兩對引物,分別以牛支原體NM2012株第6代、12代和20代菌株提取的DNA為模板,對vpmaX和GAPDH基因進(jìn)行全基因擴(kuò)增,將得到的目的片段與 pMD-19T克隆載體連接,并進(jìn)行克降,經(jīng)菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定為杴性的克隆菌液送華大基因測序。將測序結(jié)果與GenBank上登錄的NM2012株牛支原體的vpmaX和GAPDH基因進(jìn)行基因序列、氨基酸序列比對,分析其差異。結(jié)果表明,不同代次菌vpmX基因核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸同源性均為100%,GAPDH基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸同源性分別為99.9%～100%和99.7%～100%,說明牛支原體NM2012株vpmaX和GAPDH遺傳特性較穩(wěn)定。為了解牛支原體NM2012株對奶牛牛的致病性,本研究將牛支原體NM2012株第6代菌株采用氣管注射的方法對荷斯坦奶牛進(jìn)行人工感染試驗,觀察攻毒后奶牛的臨床癥狀,血液白細(xì)胞變化,牛支原體特異性抗體IgG,試驗牛于感染后14d和27d分兩批處死,剖檢動物觀察眼觀病理變化和組織學(xué)病理變化,并對肺、關(guān)節(jié)、氣管等臟器進(jìn)行分菌。結(jié)果顯示牛支原體NM2012株對三周齡奶牛具有較強(qiáng)的致病性。本研究建立一種檢測鼠抗牛支原體抗體的間接ELISA方法,并對牛支原體NM2012株免疫原性進(jìn)研究。采用經(jīng)超聲裂解后的牛支原體全菌蛋白作為包被抗原,通過方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)并對其他條件進(jìn)行優(yōu)化,建立檢測小鼠抗牛支原體血清抗體的間接ELISA方法。經(jīng)驗證該方法的重復(fù)性和特異性較好,用該方法檢測牛支原體NM2012株接種小鼠后不Q嬍奔潿窩逯惺罌古Ｖг宓目固逅

本文編號：2761685