【摘要】：作為粘細(xì)菌的模式菌,黃色粘球菌具備多細(xì)胞水平的典型社會(huì)性特征,能夠進(jìn)行復(fù)雜多樣化的細(xì)胞行為并貫穿于其生命周期的各個(gè)環(huán)節(jié),主要包括:在固體介質(zhì)表面進(jìn)行的群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程;群體細(xì)胞的捕食過程;子實(shí)體的發(fā)育。其中社會(huì)性細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(S運(yùn)動(dòng))是黃色粘球菌進(jìn)行捕食和分化發(fā)育的行為基礎(chǔ),其分子機(jī)制的解析對(duì)黃色粘球菌多細(xì)胞水平的社會(huì)性行為研究具有重要的理論指導(dǎo)意義。S運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)主要介導(dǎo)了黃色粘球菌細(xì)胞在固體表面的群體運(yùn)動(dòng)過程,與銅綠假單胞菌的顫動(dòng)系統(tǒng)非常類似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)參與的收縮模型是目前普遍接受的S運(yùn)動(dòng)分子機(jī)制。EPS為TFP的收縮提供了錨定的位點(diǎn);細(xì)胞前導(dǎo)端伸出的TFP細(xì)絲抓住附近細(xì)胞產(chǎn)生的EPS并激發(fā)收縮,從而拉動(dòng)細(xì)胞以粘-滑交替的方式前行。在這一過程中,TFP與EPS這兩個(gè)胞外生物大分子之間的特異性相互作用的實(shí)質(zhì)是極為重要的科學(xué)問題。在本學(xué)位論文中,我們對(duì)組成TFP的菌毛蛋白PilA與EPS在互作過程中各自參與識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了探尋。首先,我們利用表面等離子共振的方法,基于直接偶聯(lián)、多循環(huán)動(dòng)力學(xué)-捕獲、單循環(huán)動(dòng)力學(xué)-捕獲以及多循環(huán)動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)等手段構(gòu)建了 PilA-糖類生物大分子體外相互作用的檢測(cè)體系。首先分析了 EPS天然類似物殼聚糖與PilA蛋白的相互作用。結(jié)果顯示,不同分子量的殼聚糖均可以通過直接偶聯(lián)的方式與PilA蛋白相互作用。隨后,根據(jù)提取方法的不同,我們從黃色粘球菌DK1622菌株中獲取了可溶性與不可溶性的EPS,在直接偶聯(lián)模式下,無論是可溶性還是不可溶性的EPS均與PilA蛋白存在相互作用。直接偶聯(lián)法由于偶聯(lián)的方式簡(jiǎn)單被廣泛應(yīng)用,但是該方法也存在特異性吸附以及蛋白偶聯(lián)方向不一致導(dǎo)致蛋白結(jié)合位點(diǎn)被屏蔽等弊端。因此,我們改進(jìn)了檢測(cè)手段,建立了多循環(huán)動(dòng)力學(xué)-捕獲法以及單循環(huán)動(dòng)力學(xué)-捕獲法,EPS與PilA蛋白相互作用的陽(yáng)性信號(hào)響應(yīng)值明顯增大。既然EPS與PilA蛋白間存在相互作用,那么EPS參與識(shí)別PilA蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)是什么?我們分別檢測(cè)了參與構(gòu)成EPS的各個(gè)單糖組分與PilA蛋白之間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示,含有氨基的單糖能夠與PilA蛋白結(jié)合,而無修飾的單糖以及N-乙酰修飾的氨基單糖均不能與PilA蛋白結(jié)合。該結(jié)果與等溫滴定量熱儀測(cè)定的結(jié)果一致。同時(shí),基于多循環(huán)動(dòng)力學(xué)-捕獲法的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葡萄糖胺能夠與EPS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PilA蛋白。另一方面,我們對(duì)PilA蛋白參與識(shí)別EPS的關(guān)鍵位點(diǎn)也進(jìn)行了分析。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果,我們推測(cè)PilA蛋白中有22個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)可能參與了 EPS的識(shí)別。從中選取了 3個(gè)位點(diǎn),即Tyr69、Trp146、Trp181,分別將其突變成為Ala。體外互作的結(jié)果顯示,PilA(W146A、W181A)突變型蛋白和EPS的相互作用與野生型蛋白無差別,而PilA(Y69A)突變型蛋白與氨基糖類的相互作用消失,推測(cè)Tyr69可能是PilA蛋白與EPS互作識(shí)別時(shí)的關(guān)鍵位點(diǎn)。隨后,將含有突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)PilA基因回補(bǔ)到PilA蛋白缺失菌株10410中,結(jié)果顯示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固體平板上的S運(yùn)動(dòng)能力喪失。在甲基纖維素實(shí)驗(yàn)中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈現(xiàn)出一定程度的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì),而菌株DK10410::PilAw181A沒有明顯運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)。Western Blot分析顯示,三種回補(bǔ)菌株均沒有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全細(xì)胞菌毛蛋白。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為Trp146突變后能夠產(chǎn)生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能進(jìn)行有效組裝,而Trp181突變后不產(chǎn)生任何的PilA蛋白。Tyr69突變后能夠產(chǎn)生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能進(jìn)行有效組裝。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：2573221