【摘要】：家蠶(Bombyx mori)因其絲腺能夠合成蠶絲而成為重要的經濟昆蟲,也作為鱗翅目昆蟲的典型代表而成為變態(tài)和發(fā)育生物學研究的模式昆蟲。后部絲腺(PSG)負責分泌合成絲素蛋白,而絲素蛋白是蠶絲蛋白的主效成分,直接決定著蠶絲蛋白的質量和產量。對家蠶絲素蛋白合成調控機制的闡明,將為今后蠶業(yè)分子育種提供重要的理論參考。家蠶絲腺轉錄因子SGF1(Silk Gland Factor 1)屬于FOXA轉錄因子家族,是家蠶中首個被報道參與調控絲素蛋白轉錄的重要因子。合作實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),Ras1cA轉基因家蠶后部絲腺中SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的磷酸化水平升高,推測磷酸化升高的SGF1與轉基因家蠶蠶絲產量升高相關,而SGF1磷酸化水平變化如何影響其對絲素蛋白相關基因的轉錄調控,且在該過程中如何受到Ras1下游Raf/MAPK或PI3K/AKT信號通路的調控,還有待探究。本研究運用生物信息軟件對家蠶SGF1基因進行分析,并對SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的位點和調控的激酶進行預測;對制備的SGF1全長和磷酸化抗體進行體外驗證和體內的PSG發(fā)育表達譜分析;運用Western blot和免疫熒光染色方法在體內初步明確SGF1的核定位與其調控絲素蛋白基因的功能呈正相關;利用Raf/MAPK或PI3K/AKT信號通路抑制劑對蟲體進行處理以明確哪條信號通路對SGF1核定位起到主要作用;最終在家蠶和哺乳動物細胞系中進一步研究了 Raf/MAPK或PI3K/AKT抑制劑對SGF1和SGF1同源基因FoxA1核定位的影響是否通過磷酸化調控的方式實現(xiàn)。主要內容和結果如下:1.全長和磷酸化SGF1抗體的驗證及SGF1在家蠶后部絲腺中的表達譜分析根據(jù)已知的SGF1全長和磷酸化肽段序列信息,制備全長和磷酸化抗體。構建pIEx4-SGF1-V5和pIEx4-SGF1s91A-V5兩種質粒,在家蠶BmN細胞系中轉染并進行Western Blot驗證。隨后,對家蠶后部絲腺SGF1基因時空表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn)從4齡第4天(4L4D)開始一直到5齡第3天(5L3D),SGF1的轉錄水平逐漸增加,隨后開始逐漸降低,對家蠶后部絲腺SGF1蛋白表達模式進行分析,發(fā)現(xiàn)從4齡第4天(4L4D)開始一直到5齡第7天(5L7D),其蛋白表達水平逐漸增加,而從5L7D開始,其蛋白表達水平迅速下降。2.家蠶體內SGF1的核定位與其絲素蛋白表達調控的相關性分析利用免疫熒光染色方法對SGF1在家蠶后部絲腺不同發(fā)育階段的定位進行檢測,結果表明在家蠶攝食期,SGF1普遍存在核定位現(xiàn)象。即在預蛹1天(PP1)之前SGF1 一直位于細胞核內,而在預蛹2天(PP2)時SGF1位于細胞核外,因此從PP1到PP2的過程中SGF1核定位發(fā)生改變,即由原來SGF1聚集在核內變化為彌散在核外。進一步實驗以確證SGF1出核的時間窗口,發(fā)現(xiàn)其具體出核時間為上簇36h(W36h)。利用免疫熒光染色方法和Western Blot比較W36h時期Ras1CA轉基因家蠶和野生型家蠶中SGF1定位和表達,發(fā)現(xiàn)與野生型家蠶相比,轉基因家蠶的SGF1依舊定位在細胞核中且蛋白表達量較高。3.體內研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路對SGF1核定位的影響為分析Ras下游Raf/MAPK或PI3K/AKT通路如何影響SGF1的表達和定位。本研究采用Raf/MAPK抑制劑為PLX和PD60,PI3K/AKT/TORC1的抑制劑為Wort、Rapa和LY294。在家蠶蟲體水平進行抑制劑處理,經免疫組織化學染色實驗和Western Blot實驗結果表明,處理后的SGF1表達量減少并且不在核內,因此說明這兩種信號通路參與調控其核定位過程。4.體外研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路對SGF1核定位的影響在BrnN細胞中通過抑制劑處理和點突變實驗進一步驗證Raf/MAPK或PI3K/AKT通路通過調控SGF1 Ser91位點影響其核定位功能。為明晰該調控機制是否存在進化上的保守性,構建SGF1的同源基因FoxA1的野生型和點突變載體,利用免疫組織化學染色實驗和Western Blot研究FoxA1的可能磷酸化位點以及所受信號通路調控,結果發(fā)現(xiàn)FoxA1磷酸化位點與核定位無關,但其核定位功能受Raf/MAPK信號通路調控。綜上所述,家蠶后部絲腺中的SGF1核定位受到Raf/MAPK和PI3K/AKT/TORC1信號通路的調控,且與SGF1對絲素蛋白合成調控正相關。
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q963

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 赤井弘;崔立旺;;家蠶絲腺細胞的超微結構及其功能[J];國外農學-蠶業(yè);1986年02期

相關博士學位論文 前1條

1 趙小明;家蠶絲腺特異表達的bHLH轉錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究[D];西南大學;2014年

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本文編號：2572410