【摘要】：疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種與人類的日常生活密切相關(guān)且分布廣泛的嗜熱真菌,在真核生物中生長上限溫度是最高的。目前,從該菌中已分離得到了多種嗜熱酶,真核表達后廣泛應用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和微生物研究中,使得該菌在醫(yī)藥、釀造業(yè)、發(fā)酵業(yè)、廢物處理等多個領(lǐng)域中的影響越來越大。因而,近年來科研工作者的研究主要集中在熱穩(wěn)定的蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、幾丁質(zhì)分解酶及木聚糖酶等嗜熱酶基因的克隆及其生理生化性質(zhì)方面,而對于該菌株特定基因遺傳功能的研究至今少有報道。對于絲狀真菌而言,在稻瘟病菌中CAP基因缺失后,會影響細胞的活力及附著胞的形成進而降低致病能力。通過序列比對發(fā)現(xiàn),在疏綿狀嗜熱絲孢菌中也存在CAP同源基因,且與稻瘟病菌中的CAP1基因的同源性為42.75%。通過生物信息學分析可知,CAP屬于CAP_C超家族中的成員,亞細胞定位預測定位于細胞膜上,含有CARP結(jié)構(gòu)域且高度保守。NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,分析親緣關(guān)系可知:與曲霉菌(Aspergillus lentulus)的進化距離最近,其與人類(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)的進化距離最遠。為了進一步探知CAP的功能,我們通過構(gòu)建CAP基因的敲除載體及互補/亞細胞定位載體,進而采用ATMT法轉(zhuǎn)化疏綿狀嗜熱絲孢菌的分生孢子獲得了CAP基因的敲除突變株△CAP;然后,以十字花科炭疽病菌中的CAP(CH07570-△CAP,CH14404-△CAP)/稻瘟病菌中的CAP(MGG01722.6-△CAP)基因為互補序列,通過PEG介導的遺傳轉(zhuǎn)化疏綿狀嗜熱絲孢菌原生質(zhì)體,得到了互補/亞細胞定位突變株△CAP/CAP。以野生型菌株9w-WT及上述突變株為研究材料,結(jié)果發(fā)現(xiàn):△CAP營養(yǎng)生長比9w-WT稍快;△CAP與9w-WT氣生菌絲類似。進行孢子振蕩培養(yǎng)試驗,觀察上述菌株的孢子形態(tài)發(fā)現(xiàn),振蕩培養(yǎng)后的9w-WT孢子呈表面光滑中空的大小較均一的圓球體,而敲除菌株△CAP則呈兩頭尖的刺狀不規(guī)則球體,互補菌株CH07570-△CAP、CH14404-△CAP呈現(xiàn)大小差異較大的中空的圓球體,互補菌株MGG01722.6-△CAP呈輻射狀表面粗糙的不規(guī)則圓球體。這一生物學特征可能與CAP參與細胞表面識別有關(guān)。因此,CAP對于維持疏綿狀嗜熱絲孢菌的營養(yǎng)生長是必不可少的。產(chǎn)孢量統(tǒng)計可知,9w-WT的孢子量是△CAP的2倍多;進一步測定孢子萌發(fā)萌發(fā)率發(fā)現(xiàn),△CAP的孢子萌發(fā)率與9w-WT相比沒有明顯差異,且互補菌株孢子萌發(fā)率在一定程度上野生型菌株孢子萌發(fā)率相當。因而,CAP不影響疏綿狀嗜熱絲孢菌的孢子萌發(fā)活力。我們還做了相關(guān)逆境脅迫試驗,1、H2O2脅迫試驗:與野生型相比,敲除菌株△CAP對H2O2敏感性降低。與各菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)類似,出現(xiàn)了菌落顏色的變化,這與上述菌株的產(chǎn)孢情況相對應。2、細胞壁完整性試驗:相對于野生型菌株和互補菌株,△CAP菌株對Congo-Red及SDS不敏感,由此可見,CAP基因與疏綿狀菌細胞壁的完整性有關(guān),且CAP的表達是對外界環(huán)境中基礎逆境的響應。3、滲透脅迫試驗:相對于野生型菌株,敲除菌株對滲透壓影響因子更加敏感,抑制疏綿狀嗜熱絲孢菌的生長,而互補菌株則不同程度地恢復了菌株的滲透抗逆反應。綜上表明,CAP對于維持疏綿狀嗜熱絲孢菌的生長發(fā)育過程以及逆境應答響應是必不可少的。為了探究外源加入c AMP對上述敲除菌株及互補菌株的影響,在CM及PDA培養(yǎng)基中加入c AMP,結(jié)果發(fā)現(xiàn),上述菌落顏色均呈現(xiàn)棕黃色且滲透至培養(yǎng)基中,這可能與代謝物質(zhì)的產(chǎn)生及產(chǎn)孢量有關(guān);此外還發(fā)現(xiàn),外源加入c AMP能有效彌補CAP缺失對疏綿狀嗜熱絲孢菌生長發(fā)育造成的不良影響,產(chǎn)孢量得到部分或完全恢復。本文是以稻瘟病菌中一個與致病性相關(guān)的CAP1基因為出發(fā)點,通過序列比對,發(fā)現(xiàn)疏綿狀嗜熱絲孢菌中也有CAP基因,本研究經(jīng)過一系列的生物信息學分析,并通過基礎試驗獲得了敲除及互補/亞細胞定位菌株,進而進行CAP功能的研究。這為以后研究疏綿狀嗜熱絲孢菌及其它嗜熱真菌特定基因的蛋白家族提供了一定的理論基礎和方法指導;也為嗜熱真菌相關(guān)基因的遺傳功能的研究打開了新的視角,以期能夠盡早探知嗜熱真菌的嗜熱機制。
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圖 1.1 CAP 蛋白結(jié)構(gòu)(圖片來自 Ksiazek et al.,2003)1 The protein structure ofAdenylate cyclase-associated protein（酸環(huán)化酶結(jié)合蛋白（CAP）的功能概述

1.2 cAMP 信號傳遞系統(tǒng)（圖片來自申s諾，

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