【摘要】：固定化酶技術是現(xiàn)代生物催化領域的研究熱點,而提高酶的穩(wěn)定性也是其工業(yè)化應用的前提和基礎。酶通過固定化以后,可以明顯地提高對外界不良環(huán)境的抗性。隨著生物催化劑在工業(yè)生產上的廣泛應用,傳統(tǒng)單一的酶固定化方法如吸附固定、包埋固定、共價結合固定和交聯(lián)固定等已經不能滿足工業(yè)化發(fā)展的需求。因此,固定化酶技術的相關研究已經向著雙重或者多重的復合固定化以及非傳統(tǒng)的酶固定化方向發(fā)展。這些新型酶固定化方法給酶的固定化發(fā)展提供了一種新的思路,能夠有效地解決傳統(tǒng)酶固定化技術存在的不足之處,制備出更加符合實際生產應用需求的固定化酶體系。本文以杏仁β-葡萄糖苷酶作為研究對象,基于水相原位聚合技術平臺,設計和制備了幾種不同尺度、不同形態(tài)結構的新型固定化β-葡萄糖苷酶,以提高酶的穩(wěn)定性。首先分別對所制備的β-葡萄糖苷酶納米凝膠、交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體(CLEAs)凝膠和杏仁粉凝膠的形態(tài)結構進行一系列表征,然后進一步對其制備工藝條件、酶學性質以及催化性能等方面進行系統(tǒng)的研究和討論,為其工業(yè)化應用提供理論基礎。主要研究內容如下:(1)采用水相原位聚合技術兩步反應制備了 β-葡萄糖苷酶納米凝膠,通過對制備工藝條件的優(yōu)化,β-葡萄糖苷酶納米凝膠的酶活保留率可達81.4%。紅外光譜、凝膠電泳、動態(tài)光散射、掃描電鏡和熒光光譜等分析結果顯示,所制備的β-葡萄糖苷酶納米凝膠為單分子酶納米凝膠,粒徑主要分布在15nm～40nm之間,納米凝膠層厚度約為3.5nm,而且保持了天然酶蛋白結構。酶學性質研究結果表明,β-葡萄糖苷酶納米凝膠的Km值為3.61mmol/L,Vmax值為2.52μmol/(min·mg),較天然酶對底物的親和力僅略有下降,但β-葡萄糖苷酶納米凝膠的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性以及儲存穩(wěn)定性等方面較天然酶都有顯著提高。(2)利用β-葡萄糖苷酶納米凝膠作為催化劑,以葡萄糖和酪醇為底物,在非水相體系中逆水解反應直接糖基化合成紅景天苷。對影響合成紅景天苷的多種因素如反應體系的有機溶劑種類、含水量、加酶量、pH、溫度和底物濃度等作了考察。實驗得到最優(yōu)條件為:以叔丁醇作為有機溶劑,反應體系含水量為5%,加酶量為4.0U/mL,反應體系pH值為6.0,反應溫度為60℃,葡萄糖和酪醇的濃度分別為300mmol/L和900mmol/L。在此條件下,經過96h的反應,紅景天苷的濃度為71.13mmol/L,收率達到23.7%。(3)采用三相法從苦杏仁粗酶提取液中分離制備β-葡萄糖苷酶。分別研究了有機溶劑種類及濃度、硫酸銨飽和度、體系pH值和溫度對三相分離過程的影響。研究結果表明:叔丁醇作為最佳有機溶劑,粗提物與叔丁醇的體積比為1.0:1.5,硫酸銨飽和度為50%,體系最佳pH值為5.0,最佳溫度為25℃。在此優(yōu)化條件下,苦杏仁β-葡萄糖苷酶的純化倍數(shù)達到5.97,酶活回收率為85.7%。(4)以三相法分離制備的杏仁β-葡萄糖苷酶為研究對象,把交聯(lián)酶聚集體技術和水相原位聚合技術相結合制備了CLEAs凝膠。通過對制備工藝條件的優(yōu)化,CLEAs凝膠的酶活保留率可達62.7%。形態(tài)結構表征結果顯示,所制備的CLEAs凝膠的平均粒徑約為50.390μm,聚合物殼層厚度在700nm左右。酶學性質研究結果表明,CLEAs凝膠的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及有機溶劑耐受性相比于游離酶和CLEAs得到顯著提高。在連續(xù)催化紅景天苷的合成反應中,CLEAs凝膠仍能夠保持較高的催化合成效率,其催化效果要遠遠好于游離酶和CLEAs。(5)以天然杏仁粗粉作為β-葡萄糖苷酶載體,基于水相原位聚合技術成功制備了杏仁粉凝膠,其催化活性為天然杏仁粉的78.8%。通過形態(tài)結構表征分析可知,所制備的杏仁粉凝膠的平均粒徑約為45.437μm,表面聚合物殼層厚度僅有460nm。酶學性質研究結果表明,表面具有聚合物殼層的杏仁粉凝膠在酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性以及重復操作穩(wěn)定性等方面相比于天然杏仁粉都得到了顯著提高。在連續(xù)進行5個批次反應合成紅景天苷時,紅景天苷的平均收率可達16.1%,而其平均催化合成能力為3.63g/(L·U),與天然杏仁粉相比杏仁粉凝膠表現(xiàn)出絕對的生產優(yōu)勢,因此具有廣泛的工業(yè)應用前景。
【學位授予單位】：安徽工程大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q814.2

【參考文獻】

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本文編號：2513958