【摘要】：肝受體同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1,NR5A2),隸屬于核受體NR(nuclear receptor)5A亞家族,是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。LRH-1的結(jié)構(gòu)在脊椎動物中十分保守。其在機體代謝、發(fā)育、膽汁酸動態(tài)平衡和類固醇生成中起著重要的作用。LRH-1在垂體、腎上腺、脂肪、胰腺、肝臟、腸道、精巢、卵巢等器官中表達。在哺乳動物中,LRH-1主要表達在各發(fā)育階段卵巢的濾泡顆粒細胞(Granulosa cells)和黃體細胞中,在鞘膜細胞(Theca cells)中沒有表達;在精巢生殖細胞和萊氏細胞(Leydig cells)中有表達,在支持細胞(Sertoli cells)中沒有表達。在小鼠中,LRH-1純合敲除致死。雜合突變雄鼠的附睪和精囊體重比正常小鼠低,Star、Scc、3β-HSD等類固醇生成因子表達含量下降;雜合突變LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等類固醇基因表達水平降低而導致小鼠不能排卵。顆粒細胞特異性條件敲除LRH-1雌鼠不育,不能排卵。在硬骨魚類中,利用RT-PCR的方法證實了LRH-1在腦、垂體、鰓絲、鰾、肝臟、腸道、脂肪、血液、卵巢以及腎臟和頭腎中均有表達。在石斑魚中,LRH-1表達在卵巢的濾泡細胞和生殖細胞中。有體外實驗證明LRH-1可以結(jié)合在cyp19a1a和cyp19a1b的啟動子上并激活它們的表達。在脊椎動物中,至今沒有LRH-1在小鼠以外的功能研究報道,也沒有對羅非魚LRH-1的表達和功能進行系統(tǒng)的研究報道。在本研究中,利用RT-PCR,Western blot以及免疫組織化學方法研究了LRH-1在羅非魚不同組織和雌雄性腺不同發(fā)育階段中的表達以及細胞定位;并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對尼羅羅非魚中的LRH-1進行突變,獲得了F0代陽性魚和F1代雜合子,進一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究結(jié)果如下:通過中山大學張為民教授實驗室獲得斑點石斑魚LRH-1抗體,利用ClustalX軟件對用于制作石斑魚LRH-1多克隆抗體的抗原氨基酸序列(172-288)和羅非魚的LRH-1相應蛋白氨基酸序列進行比對,發(fā)現(xiàn)石斑魚抗原部分98%的氨基酸序列都可以比對到羅非魚的蛋白氨基酸序列上。證明石斑魚的LRH-1抗體可以用來檢測羅非魚的LRH-1蛋白。我們通過Western blot結(jié)果顯示:石斑魚的LRH-1多克隆抗體能特異識別羅非魚的LRH-1天然蛋白(85 kDa),并發(fā)現(xiàn)LRH-1在羅非魚的精巢、卵巢中均有一條主帶,且在心臟、腦、肝臟中表達。RT-PCR結(jié)果顯示LRH-1可在羅非魚腦、鰓絲、心臟、脾、肝臟、腸、卵巢、精巢、肌肉等組織中表達。此外,免疫組化結(jié)果顯示:LRH-1主要表達在早期生殖細胞和類固醇生成細胞,在卵巢中表達于卵原細胞、卵母細胞、間質(zhì)細胞和鞘膜細胞,在精巢中表達于精原細胞、精母細胞和萊氏細胞。且LRH-1與Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表達于卵巢的間質(zhì)細胞和鞘膜細胞。LRH-1和Sf-1表達模式基本一致。利用CRISPR/Cas9技術在尼羅羅非魚突變LRH-1基因,獲得F0代XX與XY的陽性魚,尾鰭突變率最高為98%,最低為50%。對F0代陽性魚分析表明:與對照XX雌魚相比,120 dah時,XX陽性魚卵巢出現(xiàn)空腔,且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表達下調(diào)。同時,通過EIA檢測顯示,XX陽性魚雌激素水平下調(diào);210dah時,XX陽性魚卵巢相比對照組卵巢表現(xiàn)為發(fā)育延遲,卵巢中還保留大量類固醇陽性細胞。通過LRH-1突變的陽性F0代XY雄魚與野生型XX雌魚雜交產(chǎn)生F1代雜合子LRH-1+/-。性腺組織檢測結(jié)果表明,與對照雌魚相比,在90 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中,間質(zhì)細胞減少,Cyp19a1a/cyp19a1a表達下調(diào),雌激素水平下調(diào)。在210 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中,卵子發(fā)育延遲,有大量卵母細胞停留在I、II時相,遲遲不能積累卵黃,且有空腔出現(xiàn),卵巢性腺成熟系數(shù)(GSI)顯著降低;與對照XY雄魚相比,90 dah時,LRH-1+/-XY雄魚精巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,但在180 dah時精巢內(nèi)部恢復正常,產(chǎn)生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表達下調(diào),雌激素水平下調(diào),雄激素水平?jīng)]有顯著變化。由于F1代雌魚不育,所以嘗試用兩種方法建立LRH-1純合突變魚,第一種方法為用F0代LRH-1突變雌魚和F0代突變雄魚雜交,嘗試在雜交后代中篩選純合子;第二種方法為用F0代突變雌魚和F1代突變雄魚雜交,嘗試在雜交后代中篩選純合子,但酶切結(jié)果顯示雜交后代均為雜合子和野生型,沒有發(fā)現(xiàn)純合子,表明純合突變致死。綜上所述,本研究結(jié)果證實在羅非魚性腺中LRH-1的表達模式與哺乳動物基本一致:在生殖細胞和類固醇生成細胞中表達。并且在硬骨魚類雌激素生成和卵子生成中具有重要作用。這反映出LRH-1在脊椎動物中的表達和功能具有保守性。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q953

【參考文獻】

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1 張偉;張堯;張君勝;王利紅;;Lrh-1基因在湖羊HPG軸中表達量變化研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2012年19期

2 徐平龍,孔玉英,謝幼華,汪垣;輔抑制子SMRT特異地抑制孤兒核受體hB1F/hLRH-1的轉(zhuǎn)錄活性(英文)[J];生物化學與生物物理學報;2003年10期

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2 王婷茹;尼羅羅非魚Dmrt1、Amh和Cyp11b2抗體制備及其在正常發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)性腺中的表達研究[D];西南大學;2013年

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本文編號：2382881