【摘要】：目的:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為人類的替身承擔(dān)藥物安全和治療效果,其質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。隨著我國(guó)科研水平的不斷提高,研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物質(zhì)量控制要求越來(lái)越嚴(yán)格。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、多殺巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、支氣管鮑特桿菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原體(Mycoplasma pneumoniae)、泰澤氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)等七種病原體是我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制需要排除的病原體,也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見的易感病原體。目前對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶的病原體主要依靠分離純化培養(yǎng)、菌落形態(tài)、鏡下觀察及生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定,檢測(cè)周期長(zhǎng),費(fèi)用高,并且需要有經(jīng)驗(yàn)的檢測(cè)人員進(jìn)行判定,漏檢、誤判時(shí)有發(fā)生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于醫(yī)療和衛(wèi)生行業(yè),但實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物質(zhì)量控制還未將PCR檢測(cè)方法納入,更沒(méi)有多重PCR方法,這已成為多種病原體或大樣本簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確鑒定的掣肘。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等優(yōu)點(diǎn)。用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè),可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體,適合大樣本的檢測(cè)與鑒定,具有高靈敏性、高特異性和低成本等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR在其他行業(yè)應(yīng)用較多,然而,目前應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原微生物檢測(cè)的研究很少。本研究目的是針對(duì)七種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體、泰澤氏菌、肺炎克雷伯桿菌,建立多重PCR檢測(cè)方法,并與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法或血清學(xué)方法比較,驗(yàn)證多重PCR檢測(cè)方法的可操作性和準(zhǔn)確性。方法:1、標(biāo)準(zhǔn)菌株的培養(yǎng)和DNA提取:將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種到SP瓊脂培養(yǎng)基,綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株接種到NAC瓊脂培養(yǎng)基,肺炎克雷伯桿菌接種到dhl瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)18-24h;多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌接種到血瓊脂培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24-48h;肺支原體接種到液體培養(yǎng)基中,一周后進(jìn)行觀察收集。按照細(xì)菌提取試劑盒方法提取各種病原體的dna,泰澤氏菌dna由中國(guó)食品藥品檢定研究院惠贈(zèng)。2、引物的設(shè)計(jì):通過(guò)查閱文獻(xiàn)和primer5.0軟件設(shè)計(jì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和泰澤氏菌的特異性引物,使用blast分析引物特異性;進(jìn)行pcr擴(kuò)增,測(cè)序鑒定。3、特異性實(shí)驗(yàn)和敏感性實(shí)驗(yàn):pcr擴(kuò)增非目的菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn);將模板dna按照10倍的比例進(jìn)行梯度稀釋,檢測(cè)pcr敏感性。4、四組多重pcr檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用4.1將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌三種細(xì)菌在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增,同時(shí)加入16srrna的引物作為內(nèi)質(zhì)控,優(yōu)化多重反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件,驗(yàn)證該多重體系的特異性和敏感性。應(yīng)用該多重反應(yīng)體系檢測(cè)人工感染的糞便樣本和76例新鮮大、小鼠糞便樣本,同時(shí)采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。4.2將多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體三種病原微生物在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增,驗(yàn)證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應(yīng)體系。應(yīng)用該多重反應(yīng)體系檢測(cè)人工感染的氣管分泌物、棉拭子樣本和182例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本,同時(shí)采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法或血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。4.3將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌和肺支原體五種病原微生物在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增,優(yōu)化多重反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件,驗(yàn)證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應(yīng)體系,應(yīng)用該多重反應(yīng)體系檢測(cè)人工感染病原菌的糞便、氣管分泌物、棉拭子和182例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本,同時(shí)采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法或血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。4.4將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和泰澤氏菌三種細(xì)菌在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增,驗(yàn)證該多重體系的特異性和敏感性,建立多重反應(yīng)體系。應(yīng)用該多重反應(yīng)體系檢測(cè)112例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便樣本,同時(shí)采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法或血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌和支氣管鮑特桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng),肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。2、獲得10對(duì)特異性引物,并通過(guò)blast比對(duì)驗(yàn)證引物的特異性,擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、肺炎克雷伯桿菌(368bp)、通用引物(520bp)、多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)、肺支原體(266bp)、泰澤氏菌(639bp)、綠膿桿菌(197bp),擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均與genebank中相應(yīng)序列一致。3、pcr特異性和敏感性實(shí)驗(yàn):金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體和泰澤氏菌特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,除標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶外,其它菌種均擴(kuò)增陰性。敏感性實(shí)驗(yàn):金黃色葡萄球菌dna檢測(cè)最低限為1pg;綠膿桿菌dna檢測(cè)最低限為10pg;肺炎克雷伯桿菌dna檢測(cè)最低限為10pg;多殺巴氏桿菌dna檢測(cè)最低限為1pg;支氣管鮑特桿菌dna檢測(cè)最低限為10pg;肺支原體dna檢測(cè)最低限為1pg;泰澤氏菌dna檢測(cè)最低限為100pg,對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)600copies/μl。4、四組多重pcr檢測(cè)方法:4.1建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、肺炎克雷伯桿菌(368bp)和16srrna(520bp)的多重pcr檢測(cè)方法。應(yīng)用多重pcr方法檢測(cè)人工感染病原菌樣本,檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性;76份大、小鼠糞便樣本多重pcr檢測(cè)結(jié)果顯示1份小鼠糞便樣本綠膿桿菌陽(yáng)性,其余樣本檢測(cè)陰性;傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果與多重pcr檢測(cè)結(jié)果一致。4.2建立多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)、肺支原體(266bp)的多重pcr檢測(cè)方法;應(yīng)用多重pcr方法檢測(cè)人工感染的氣管分泌物、棉拭子樣本,檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性;182例大小鼠、兔棉拭子樣本多重pcr檢測(cè)結(jié)果19例兔棉拭子樣本多殺巴氏桿菌陽(yáng)性,9例大鼠棉拭子肺支原體陽(yáng)性;多殺巴氏桿菌和支氣管鮑特桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果全部陰性,肺支原體血清學(xué)方法檢測(cè)9例陽(yáng)性。4.3建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(600bp)、多殺巴氏桿菌(356bp)、支氣管鮑特桿菌(237bp)和肺支原體(266bp)的多重pcr檢測(cè)方法;應(yīng)用多重pcr方法檢測(cè)人工感染的糞便、氣管分泌物和棉拭子樣本,檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性;182例大小鼠、兔糞便和棉拭子樣本多重PCR檢測(cè)結(jié)果1例小鼠糞便綠膿桿菌陽(yáng)性;傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果與多重PCR結(jié)果一致,肺支原體血清學(xué)方法檢測(cè)肺支原體全部陰性。4.4建立金黃色葡萄球菌(153bp)、綠膿桿菌(197bp)和泰澤氏菌(639bp)的多重PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用多重PCR方法檢測(cè)112例大小鼠、兔糞便樣本檢測(cè)結(jié)果全部陰性,傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌結(jié)果陰性,血清學(xué)方法檢測(cè)泰澤氏菌全部陰性。結(jié)論:針對(duì)七種病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、肺支原體、泰澤氏菌和肺炎克雷伯桿菌,根據(jù)病原菌特點(diǎn)和檢測(cè)取材方法,分別建立了四組多重PCR檢測(cè)方法。四種組合均有良好的敏感性和特異性,人工感染的樣本均檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。多重PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用顯示,多重PCR具有良好的可操作性和準(zhǔn)確性,檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)或血清學(xué)檢測(cè)方法一致,有些樣本傳統(tǒng)培養(yǎng)方法或血清學(xué)檢測(cè)方法未檢測(cè)出的,但多重PCR體系檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。本方法的建立為今后多重PCR應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q95-331

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2266181