【摘要】：肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)催化松柏醛生成松柏醇,是華細(xì)辛主要藥理活性成分甲基丁香酚生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。分離CAD基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證是調(diào)控華細(xì)辛甲基丁香酚生物合成的基礎(chǔ)工作。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到華細(xì)辛7個(gè)可能的CAD基因轉(zhuǎn)錄本(AsGAD1～7),同時(shí)通過(guò)同源克隆獲得1個(gè)華細(xì)辛CAD基因(AsCAD);對(duì)上述8個(gè)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),初步預(yù)測(cè)了華細(xì)辛CAD基因家族成員的特征;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出華細(xì)辛在不同生長(zhǎng)時(shí)期及不同組織中進(jìn)行基因表達(dá)定量分析時(shí)適宜的內(nèi)參基因18SrRNA,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行AsCADs差異表達(dá)分析;利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD基因過(guò)表達(dá)載體pK7FWG2.0-AsGAD,通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,檢測(cè)木質(zhì)素含量,驗(yàn)證基因功能。主要研究結(jié)果如下:(1)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出7個(gè)可能的華細(xì)辛GAD家族成員,分別命名為AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陸號(hào)分別為KY446440～KY446446。利用生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件對(duì)AsCADs所編碼蛋白的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能進(jìn)行分析,結(jié)果表明,AsCAD1～7分子量在30 kD～40 kD之間,屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白質(zhì),無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽,且空間結(jié)構(gòu)較保守,具有Zin1、Zin2和NADPH結(jié)構(gòu)域,屬于MDR超家族成員。(2)基于同源克隆的原理和方法,利用PCR和RACE擴(kuò)增技術(shù),分離得到1個(gè)華細(xì)辛CAD cDNA全長(zhǎng),共1357 bp,命名為AsCAD(GenBank登陸號(hào)為KT454711)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,AsGAD屬于CAD家族成員,與AsCAD2基因序列一致性達(dá)到96.14%,推測(cè)是具有功能的候選基因。(3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及分析軟件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等,從 SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP-2、GAPDH和TUB 6個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選華細(xì)辛在不同生長(zhǎng)時(shí)期(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期、花期、花后期)及不同組織中(根、根莖、葉片、葉柄、花)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因,結(jié)果表明18SrRNA在各個(gè)時(shí)期表達(dá)均比較穩(wěn)定,是進(jìn)行華細(xì)辛基因差異表達(dá)分析適宜的內(nèi)參基因。(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法,對(duì)AsCADs進(jìn)行差異表達(dá)分析,結(jié)果表明,在華細(xì)辛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,AsCADs在根、根莖、葉片、葉柄和花中均有表達(dá),但表達(dá)量不同,AsCAD3與AsCAD6表達(dá)量都相對(duì)較少�？傮w上,同一組織中,基因表達(dá)量呈現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期花期花后期的趨勢(shì)。同一時(shí)期中,AsCAD1與AsCAD的表達(dá)模式相一致,均為地下部分(根與根莖)表達(dá)量高于地上部分(葉片與葉柄)表達(dá)量,AsCAD2與AsCADA在各組織的表達(dá)量差異較大,AsGAD5在根中的表達(dá)量最高,在葉片中的表達(dá)量最低,AsGAD7在各組織表達(dá)無(wú)明顯差異,AsCAD在各組織表達(dá)水平均比較高。A5CADs表達(dá)水平的差異暗示基因功能的多樣性。(5)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD過(guò)表達(dá)載體pK7FWG2.0-AsCAD,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥�？剐院Y選以及PCR檢測(cè)結(jié)果表明,成功獲得了AsCAD過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。木質(zhì)素含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步顯示,轉(zhuǎn)基因植株主莖木質(zhì)素含量較野生型植株提高了 2.96%,增幅達(dá)到32.74%,整株植物木質(zhì)素含量提高了 3.20%,增幅達(dá)到38.60%,說(shuō)明AsCAD參與了植物木質(zhì)素的生物合成,具有酶活性。本研究從華細(xì)辛中挖掘得到AsCADs,對(duì)其進(jìn)行了差異表達(dá)分析和功能驗(yàn)證,為下階段轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行RNAi抑制表達(dá)、轉(zhuǎn)化華細(xì)辛進(jìn)行同源表達(dá),以及闡明甲基丁香酚生物合成分子調(diào)控機(jī)制奠定了工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2255131