本文選題：蘋果酸脫氫酶　切入點：絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：消去化修飾是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的罕見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,是指通過巰基進(jìn)攻不飽和氨基酸從而發(fā)生米歇爾共價加成反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)的消去化修飾蛋白只有三種,晶狀體蛋白、MAPKs和Glutathione peroxidase,而多肽有200多種。對于消去化修飾的鑒定,目前科學(xué)界并沒有較好的研究方法,為填補(bǔ)這一空白,發(fā)現(xiàn)更多的具有消去化修飾的蛋白質(zhì)及多肽,我們在本實驗室已經(jīng)成熟的標(biāo)記探針基礎(chǔ)上對大腸桿菌BL21(DE3)裂解液進(jìn)行標(biāo)記,并鑒定到了221個可能具有消去化修飾的蛋白。選取其中兩個大腸桿菌中鑒定到的可能具有消去化修飾的蛋白,蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶,進(jìn)行后期條件更加嚴(yán)格的鑒定。首先通過構(gòu)建重組菌在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),選用Ni-TED進(jìn)行親和層析純化得到純度較高的蘋果酸脫氫酶以及絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶,利用成熟探針bio-SH試劑對目的蛋白進(jìn)行初步標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)二者具有較好的Michael加成效果。同時為驗證所使用的化學(xué)探針bio-SH試劑的特異性,排除反應(yīng)中可能存在非特異性,選擇在加成反應(yīng)過程中加入已驗證的具有加成效果的DTT試劑進(jìn)行競爭,發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶Michael加成反應(yīng)有一定程度的減弱,近而說明了化學(xué)探針bio-SH試劑具有特異性。其次,將bio-SH試劑進(jìn)行過化學(xué)標(biāo)記的蛋白與Streptavidin-NHS beads進(jìn)行室溫孵育,對兩個目的蛋白進(jìn)行特異性富集純化,為后邊進(jìn)行質(zhì)譜檢測奠定了基礎(chǔ)。最后,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對大腸桿菌中蘋果酸脫氫酶進(jìn)行敲除,隨后通過對其基因缺陷株進(jìn)行回補(bǔ)以及表達(dá)純化。對目的蛋白進(jìn)行特異性化學(xué)標(biāo)記后,比較過表達(dá)蛋白與正常表達(dá)蛋白之間加成效率的差異。其中在缺陷株中蛋白過表達(dá)后其加成效率要高于大腸桿菌BL21(DE3)中正常表達(dá)的蛋白。本課題建立在本實驗室成熟的探針標(biāo)記基礎(chǔ)上,對大腸桿菌中蘋果酸脫氫酶和絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記,在排除非特異性反應(yīng)的條件下對二者進(jìn)行掛柱效率的檢測,并通過MDH基因敲除系統(tǒng)的建立,比較蛋白過表達(dá)后的加成效率為后邊質(zhì)譜檢測以及研究蛋白之間相互作用奠定了基礎(chǔ)。同時,該鑒定方法也為后邊近一步研究消去化修飾蛋白與多肽的鑒定提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Elimination modification is a new rare post-translational modification of proteins discovered in recent years. It refers to the occurrence of Michelle covalent addition reaction through sulfhydryl attack of unsaturated amino acids.At present, there are only three kinds of decontaminated modified proteins, the crystallin MAPKs and Glutathione peroxidase, and the polypeptides are more than 200.In order to fill this gap, more proteins and polypeptides with elimination modification have been found to be more suitable for the identification of decolorization modification.We labeled the cleavage solution of Escherichia coli BL21DDE3 on the basis of a mature labeling probe in our laboratory and identified 221 proteins that may have been modified by elimination.Two proteins identified in E. coli, malate dehydrogenase and serine acetyltransferase, were selected for further identification.The purified malate dehydrogenase and serine acetyltransferase were obtained by Ni-TED affinity chromatography.The mature probe bio-SH reagent was used to label the target protein, and it was found that both of them had good Michael addition effect.In order to verify the specificity of the chemical probe bio-SH reagent used and eliminate the possibility of nonspecificity in the reaction, the addition of DTT reagent with additive effect was selected to compete.It was found that the addition reaction of malate dehydrogenase and serine acetyltransferase Michael was weakened to some extent, which indicated that the chemical probe bio-SH reagent had specificity.Secondly, the proteins labeled with bio-SH reagent were incubated with Streptavidin-NHS beads at room temperature, and the two target proteins were specifically enriched and purified, which laid a foundation for the later detection by mass spectrometry.Finally, CRISPR/Cas9 gene editing technique was used to knockout malate dehydrogenase from Escherichia coli.After specific chemical labeling of the target protein, the addition efficiency difference between the overexpression protein and the normal expression protein was compared.The addition efficiency of protein in defective strain was higher than that in Escherichia coli BL21DE3.Based on the mature probe labeling in our laboratory, the chemical labeling of malate dehydrogenase and serine acetyltransferase in Escherichia coli was carried out.Through the establishment of MDH gene knockout system, the addition efficiency after protein overexpression was compared, which laid a foundation for the detection of protein by back-to-back mass spectrometry and the study of the interaction between proteins.At the same time, the identification method also provides a theoretical basis for the further study on the identification of decolorized modified proteins and peptides.
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

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本文編號：1701804