本文關(guān)鍵詞： 草酸青霉 內(nèi)切葡聚糖酶 異源表達(dá) 酶學(xué)性質(zhì) 組成型表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：自然界是豐富的生物質(zhì)資源庫(kù)。隨著化石燃料的枯竭以及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化,世界各國(guó)的科學(xué)家們將目光投向自然界中的可再生資源。利用可再生資源轉(zhuǎn)化獲得生物乙醇和生物柴油被寄予厚望。目前,在可再生資源的利用中,酶解法因?yàn)闇睾偷姆磻?yīng)條件,不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)受到青睞。目前通過遺傳操作改造單一酶組分活性來(lái)提高纖維素降解能力是一個(gè)有效的途徑,但想大幅提高纖維素酶系的纖維素降解能力很難。研究纖維素酶系各組分酶學(xué)性質(zhì)和功能,對(duì)于完善纖維素酶系的功能,重構(gòu)適合不同底物的酶復(fù)合物具有重要意義。大部分纖維素酶基因?yàn)檎T導(dǎo)表達(dá)基因,在非誘導(dǎo)條件下存在基礎(chǔ)性表達(dá)。普遍接受的模型是,基礎(chǔ)性表達(dá)的纖維素酶將外源纖維素降解為纖維寡糖,纖維寡糖進(jìn)一步誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)。除了誘導(dǎo)型基因外,還存在組成型表達(dá)的纖維素酶基因,在誘導(dǎo)前期,這些非誘導(dǎo)型纖維素酶與基礎(chǔ)性表達(dá)纖維素酶一樣——將纖維素降解為纖維寡糖,促進(jìn)纖維素酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)。鑒定這些纖維素酶的功能,對(duì)于纖維素酶基因誘導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的完善具有重要意義。本論文的主要研究進(jìn)展如下:1.內(nèi)切纖維素酶在畢赤靜母中的表達(dá)設(shè)計(jì) Cel5B、Cel5D、Cel5E、Cel5F、Cel12A、Cel12B 和 Cel12C 編碼基因引物。將酶切位點(diǎn)加在引物的5'端,并在C端添加6-8個(gè)His標(biāo)簽。以114-2的cDNA為模板,擴(kuò)增得到了其中的7個(gè)目的片段。通過限制性核酸內(nèi)切酶處理目的片段和載體,連接構(gòu)建重組載體。通過電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母。甲醇誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá),并通過SDS-PAGE進(jìn)行分析,成功獲得重組蛋白 rCel5B、rCel5E、rCel12A、rCel12B 和 rCel12C。2.重組蛋白的獲得和酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定通過親和純化獲得重組酶蛋白rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCe15B和rCel5E。以刺槐豆膠、木聚糖、CMC-N玖、pNPG、pNPX、水楊苷、蔗糖、果膠、淀粉和聚半乳糖醛酸10種底物測(cè)定重組蛋白的底物特異性。結(jié)果顯示,它們均屬于纖維素內(nèi)切酶。rCel12A、rCel12B、rCel12C、rCel5B 和 rCel5E 降解 CMC-Na 的比活力分別為 2.46IU/mg、0.97IU/mg、0.63IU/mg、2.32IU/mg 和 5.07IU/mg。其中 rCe15E 降解 CMC-Na 的能力是 rCe15B 和 rCel12A 的 2 倍,是 rCel12B 的 5.2倍、rCel12C的8.0倍。重組蛋白中,rCel12A的最適溫度是50°,其余4種重組蛋白的最適溫度均為60℃。它們的最適pH處于4-6之間,其中rCel5B、rCe15E和rCel12B的最適pH為4,rCel12C的最適pH為5,rCel12A的最適pH則為6。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示,rCel12A耐熱性差,在50℃下保溫30min之后,活力僅為初始的25%。rCel12B在50℃下保溫120 min后依然能保持50%的活力。在60℃下保溫120 min后,rCel5B和rCel5E依然保持有最初活力的60%-70%,但在70℃下,所有重組內(nèi)切酶均快速喪失活力。結(jié)果顯示GH5家族的rCel5B和rCel5E的熱穩(wěn)定性要好于來(lái)自于GH12家族的rCel12A和rCel12B。重組內(nèi)切酶水解再生無(wú)定形纖維素(RAC)的結(jié)果顯示,產(chǎn)物主要為二糖和三糖。3.組成型纖維素酶的功能初探以草酸青霉114-2為出發(fā)菌株,通過同源重組的方式獲得Δcel12C、Δcel5E、Δcel5F、Δcel61B和 Δcel61C5個(gè)單基因敲除株,Acel12CΔcel5E、Δcel5FΔcel5E、Δcel61BΔcel5E、Acel61BΔcel5F、Acel61CΔcel5E 和 Δcel61CΔcel5F6 個(gè)雙基因敲除菌株。各基因敲除株與野生菌株相比,在葡萄糖、PDA和纖維素培養(yǎng)條件下的表型以及孢子萌發(fā)水平未見明顯差異。cel12C、ce15E、cel5F、cel61B和cel61C的生物學(xué)功能需要繼續(xù)探索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1544356