本文關鍵詞：TBC1D15基因的敲除細胞系構建及其功能研究　出處：《浙江理工大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：在胰島素調(diào)控條件下,GLUT4協(xié)助葡萄糖從細胞外順濃度梯度,在囊泡的參與下進入細胞。Rab蛋白(Ras超家族的成員)參與這一重要生理過程,而TBC家族蛋白質(zhì)參與Rab的GTPase活性調(diào)節(jié)。因此,通過研究TBC蛋白質(zhì)有助于深入研究血糖調(diào)節(jié)作用的分子機制,從而發(fā)現(xiàn)治療血糖代謝相關疾病(例如:2型糖尿病)的新的藥物靶點。目前TBC蛋白質(zhì)家族成員TBC1D1、TBC1D4、TBC1D13已被證實參與GLUT4囊泡轉(zhuǎn)運過程,調(diào)節(jié)胰島素信號途徑,但未見TBC1D15參與該過程的相關報道。先前研究表明,從條紋斑竹鯊中發(fā)現(xiàn)的天然活性肽是TBC1D15的N端的一部分序列,天然的鯊肝肽(Active peptide from shark liver,APSL)能夠保護受損肝臟,改善并修復胰島β細胞損害�；蛐蛄斜葘Y果表明:條紋斑竹鯊TBC1D15與人TBC1D15相似性為67%,TBC域相似性高達91%,具有高度同源性;因此,我們推測TBC1D15很可能參與胰島素信號途徑,調(diào)節(jié)血糖代謝過程。利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除HeLa細胞中的TBC1D15基因,從細胞水平上研究TBC1D15是否與糖代謝相關。本研究基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)開展構建基因敲除細胞系的構建。首先針對TBC1D15的外顯子進行gRNA設計,運用Cas9(D10A)蛋白通過配合一對gRNA分別靶定到靶定位點的DNA互補鏈中,從而形成功能性的雙鏈斷裂,產(chǎn)生雙切口的原理(降低脫靶效應)設計并獲得7對gRNA序列,隨后將這7對gRNA序列分別構建至pX462(含嘌呤霉素抗性基因)載體中,通過測序及比對驗證,成功構建了7對含gRNA的重組質(zhì)粒。MTT實驗獲得HeLa細胞的嘌呤霉素篩選濃度為1μg/mL。隨后,將每對質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染He La細胞,轉(zhuǎn)染24h后,換成含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選細胞株,待陰性對照即正常He La細胞全部死亡后,用有限稀釋法挑選出單克隆細胞株,隨后進行擴大培養(yǎng)并進行驗證實驗。通過形態(tài)學觀察獲得一株形態(tài)異常的單克隆細胞株,且生長速度較正常HeLa細胞慢,隨后利用Western Blotting、qRT-PCR、基因組PCR分別驗證TBC1D15的表達、轉(zhuǎn)錄和基因組水平的變化。Western Blotting未檢測到該細胞株TBC1D15的明顯表達,qRT-PCR表明其mRNA轉(zhuǎn)錄水平上降低90%,基因組PCR顯示該細胞株TBC1D15有大片段的刪除。這些結果表明該株細胞為一株TBC1D15基因敲除的細胞株。通過2-NBDG葡萄糖熒光類似物培養(yǎng)后,經(jīng)流式細胞儀檢測,證實:在細胞水平上,所得到的TBC1D15基因敲除細胞株糖吸收降低,提示TBC1D15在糖吸收中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Under the regulation of insulin, GLUT4 assists glucose from the extracellular concentration gradient and enters the cell with the involvement of vesicles. Rab proteins (members of the Ras superfamily) are involved in this important physiological process, and TBC family proteins are involved in the regulation of GTPase activity of Rab. Therefore, the study of TBC protein is helpful to further study the molecular mechanism of glycemic regulation, and find a new drug target for the treatment of glycemic related diseases (such as type 2 diabetes). At present, TBC protein family members TBC1D1, TBC1D4 and TBC1D13 have been proved to be involved in GLUT4 vesicle transport process, regulating insulin signaling pathway, but no TBC1D15 has been involved in this process. The previous studies show that bioactive peptides from c.plagiosum is TBC1D15 in the N terminal part of the sequence of shahepatide (Active peptide from shark natural liver, APSL) can protect damaged liver, improve and repair the islet beta cell damage. Gene sequence alignment results showed that chiloscylliumplagiosum TBC1D15 and TBC1D15 67% similarity to the TBC domain, the similarity of up to 91%, with a high degree of homology; therefore, we hypothesized that TBC1D15 might be involved in insulin signaling pathways that regulate glucose metabolism process. The CRISPR-Cas9 system was used to knock off the TBC1D15 gene in HeLa cells and to study whether TBC1D15 was associated with glucose metabolism at the cell level. In this study, the construction of gene knockout cell lines was constructed based on the CRISPR-Cas9 system. According to the TBC1D15 exons of gRNA design, the use of Cas9 (D10A) protein with a pair of gRNA were targeted to the target sites of the DNA complementary chain, thus forming a double strand breaks of the principle of double incision (to reduce the Miss effect and get 7) design of gRNA sequence, then the 7 gRNA sequences were constructed to pX462 (containing the puromycin resistance gene) vector, by sequencing and comparison and verification, successfully constructed the recombinant plasmid containing gRNA to 7. The concentration of purinomycin in HeLa cells was 1 micron g/mL from the MTT test. Then, each of the plasmids were transfected into He La cells after 24h transfection into cultured in puromycin containing medium screening cells to normal cells in negative control He La died after using limited dilution method selected monoclonal cell lines were subsequently expanded in culture and experimental verification. A morphologically abnormal monoclonal cell line was obtained through morphological observation, and its growth rate was slower than that of normal HeLa cells. Subsequently, Western Blotting, qRT-PCR and genomic PCR were used to verify the expression, transcription and genomic level of TBC1D15. Western Blotting did not detect the expression of TBC1D15 in the cell line. QRT-PCR showed that the transcriptional level of mRNA decreased by 90%. Genomic PCR showed that TBC1D15 deleted from the cell line. These results suggest that the cell is a cell strain of TBC1D15 gene knockout. After 2-NBDG glucose fluorescence analogue was cultured, it was confirmed by flow cytometry. At the cell level, the glucose absorption of TBC1D15 knockout cell lines decreased, suggesting that TBC1D15 plays an important role in sugar absorption.
【學位授予單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1347031