本文關(guān)鍵詞：粘細(xì)菌中利用CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制基因表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：粘細(xì)菌是原核生物中具有最復(fù)雜社會(huì)運(yùn)動(dòng)的一類(lèi)細(xì)菌,具有復(fù)雜的細(xì)胞行為、多種信號(hào)調(diào)控途徑、能產(chǎn)生大量活性次級(jí)代謝產(chǎn)物,但其代時(shí)長(zhǎng)、培養(yǎng)及遺傳操作困難,其基因功能和化合物的生產(chǎn)沒(méi)能有效地探究和開(kāi)發(fā)。CRISPR-cas9是微生物的一種的免疫系統(tǒng),經(jīng)過(guò)不斷地發(fā)展,將其改造成了一種新型基因編輯工具。將Cas9蛋白的核酸酶位點(diǎn)突變(變?yōu)閐ead cas9簡(jiǎn)稱(chēng)dcas9)以后,CRISPR-dcas9不能切割靶基因,但能抑制該基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)展成一種新的基因調(diào)控工具。當(dāng)在dCas9蛋白上融合不同的效應(yīng)元件時(shí)能實(shí)現(xiàn)不同的目的,如融合RNA聚合酶的ω亞基,使其在靶基因啟動(dòng)子上游招募RNA聚合酶,實(shí)現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。CRISPR-cas9/dcas9具有無(wú)物種限制,基因調(diào)控方式多樣,基因修飾率高,可實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)調(diào)控操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此,在粘細(xì)菌中引入該系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的探究。論文選用的CRISPR-cas9系統(tǒng)來(lái)源于釀膿鏈球菌,cas9基因的GC含量?jī)H為31%,而黃色粘球菌DK1622基因組的平均GC含量為67%,cs9基因在黃色粘球菌中對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA出現(xiàn)頻率較低。cas9基因經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后(稱(chēng)為mxcas9),GC含量提高到61%,密碼子對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA出現(xiàn)頻率達(dá)到最大。mxcas9基因通過(guò)Red/et技術(shù)將核酸酶位點(diǎn)突變,再利用整合質(zhì)粒將其插入到細(xì)菌基因組。sgRNA利用PZJY41質(zhì)粒表達(dá),該質(zhì)粒由PMF1質(zhì)粒改造而來(lái)。利用構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制piLA和difA基因時(shí),抑制菌株與野生型菌株表型有顯著差異。抑制0049基因時(shí),抑制菌株和野生菌株之間不形成界限。在粘細(xì)菌中構(gòu)建好的CRISPR-dcas9能在一定程度上抑制靶基因的表達(dá),但不能完全沉默基因。為提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)的抑制效率,需對(duì)CRISPR-dcas9系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。提高CRISPR-dcas9系統(tǒng)對(duì)靶基因的抑制效率,首先提高sgRNA和dcas9在細(xì)胞中的濃度,將它們的啟動(dòng)子都改為強(qiáng)啟動(dòng)子(sgRNA用的是強(qiáng)啟動(dòng)子pili,僅需更換dcas9啟動(dòng)子)。更換啟動(dòng)子后利用該系統(tǒng)抑制pilA基因,pilp基因的表達(dá)量并沒(méi)有明顯的下降。之后,利用sgRNA靶向同一基因的不同部位,發(fā)現(xiàn)越靠近基因末端,抑制效率越低�？傮w而言,在粘細(xì)菌中構(gòu)建的CRISPR-dcas9系統(tǒng)能使靶基因的表達(dá)量下降約2/3。丙酰輔酶A和甲基丙二酸單酰輔酶A分別是埃博霉素A和埃博霉素B的底物,它們?cè)诩?xì)胞中的濃度維持較低水平,利用CRISPR-dcas9系統(tǒng)抑制它們的其他支路以提高埃博霉素的產(chǎn)量。丙酰輔酶A是脂肪酸合成的重要底物,利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的翻譯起始位點(diǎn)后,與對(duì)照菌株相比,埃博霉素A的產(chǎn)量有一定的提高,但埃博霉素總產(chǎn)量卻降低了,原因是菌株的生長(zhǎng)受到了明顯影響。利用CRISPR-dcas9抑制脂肪酸合成酶基因的ORF末端,埃博霉素A產(chǎn)量明顯提高,與埃博霉素B產(chǎn)量幾乎相同(ZE9菌株中埃博霉素A:埃博霉素B≈1:3)。甲基丙二酸單酰輔酶A可以被甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶和甲基丙酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì),抑制甲基丙二酸單酰輔酶A,埃博霉素產(chǎn)量下降;抑制甲基丙酰輔酶A羧基轉(zhuǎn)移酶,埃博霉素產(chǎn)量有一定提高。dcas9蛋白融合RNA聚合酶的ω或α亞基后能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,利用系統(tǒng)激活埃博霉素基因簇時(shí),前者能提高埃博霉素產(chǎn)量,后者反而使埃博霉素總產(chǎn)量降低。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1329802