發(fā)布時(shí)間：2017-12-24 08:01

  本文關(guān)鍵詞：人骨形態(tài)蛋白2在畢赤酵母中的表達(dá)和生物活性測定　出處：《天津工業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 畢赤酵母 融合表達(dá) 生物活性測定

【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員中最有效的成骨信號(hào)分子之一,已被證明是刺激成骨和軟骨再生的較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)因子,并且其目前已用于多種骨折的治療,例如骨缺損,非結(jié)合性骨折,脊柱融合,骨質(zhì)疏松和根管手術(shù)等。然而直接從骨頭中分離BMPs具有成本高、產(chǎn)量低(1-3 μg/kg)和純化方案復(fù)雜等問題,而且不能很好地保持其生物活性。因此選擇基因重組的方式表達(dá)BMP2蛋白。為避免大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白表達(dá)和純化過程中可能發(fā)生的表達(dá)率低,包涵體形成,蛋白的不正確折疊和毒性等問題,以巴斯德畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)作為替代方案,描述了通過體外分泌產(chǎn)生具有生物活性的 rhBMPs。本研究的主要目的是開發(fā)一種高產(chǎn)量和簡易的rhBMP2生產(chǎn)過程。首先對BMP2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,選取編碼其前肽和成熟肽部分的基因作為表達(dá)的基因序列,并設(shè)計(jì)EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)、蛋白純化標(biāo)簽6×His,成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-BMP2與pPICZαA-BMP2,線性化表達(dá)質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)進(jìn)GS115和X33菌株,并篩選高拷貝菌株誘導(dǎo)表達(dá);其次,對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定分析,利用Ni2+-NTA柱純化rhBMP2蛋白,并對誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、初始菌濃度、培養(yǎng)基pH等條件進(jìn)行優(yōu)化,通過Human BMP2 ELISA Kit對rhBMP2進(jìn)行定量分析,確定最佳表達(dá)條件;最后,利用BMP2蛋白對小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)增殖分化的作用,測定堿性磷酸酶(ALP)活性,MTT法測定細(xì)胞的增殖分化能力,進(jìn)行茜素紅染色觀察鈣沉積情況,并對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定分析。結(jié)果成功篩選出抗3 mg/mLG418的高拷貝重組菌株GS115/pPIC9K-BMP2,其最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為初始菌濃度OD600nm=1.0,甲醇濃度1.0%,誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH6.0,誘導(dǎo)72 h,且rhBMP2最高表達(dá)量為189.6μg/L,蛋白濃度為10 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出良好的生物活性,ALP活性最大為40.4 U/L。
【學(xué)位授予單位】：天津工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q51

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1327506