本文關(guān)鍵詞：小分子IWR1維持小鼠上胚層干細(xì)胞自我更新的機(jī)制探究　出處：《安徽大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：干細(xì)胞是一類具有自我更新能力的細(xì)胞,在體外培養(yǎng)條件下可無限增殖,同時保持著分化為不同類型細(xì)胞和組織的潛能,現(xiàn)已成為研究基因功能、篩選藥物和制造疾病動物模型的強(qiáng)有力工具之一,具有巨大的應(yīng)用前景。小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是第一株在體外成功建立的干細(xì)胞系。此后,人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)系也得以成功構(gòu)建。2007年,科學(xué)家們又從小鼠著床后的囊胚上胚層中分離得到一種新型的干細(xì)胞——小鼠上胚層干細(xì)胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)。值得關(guān)注的是,mEpiSCs與mESCs雖然具有相同的物種屬性,但二者在生物學(xué)特性上存在較大差異,而mEpiSCs與hESCs之間卻表現(xiàn)出許多更為相似的特性。由于人源性,hES C s無法進(jìn)行嵌合體實驗或其它涉及倫理問題的研究,在此種情況下,mEpiSCs則可以充當(dāng)相應(yīng)空白領(lǐng)域的補(bǔ)充材料,而對于mEpiSCs的深入研究,也是對整個干細(xì)胞研究領(lǐng)域的拓展,有利于擴(kuò)大人們對于干細(xì)胞內(nèi)部信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。早期分離得到的mEpiSCs被培養(yǎng)在人工合成培養(yǎng)基(chemically defined medium,CDM)中,并加入細(xì)胞因子激活素A(ActivinA)和成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast grow factors-2,FGF2)來維持細(xì)胞的自我更新狀態(tài)。但此種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞易出現(xiàn)生長緩慢、不耐受單細(xì)胞消化、易凋亡等問題。經(jīng)改進(jìn)后的培養(yǎng)條件,以10%胎牛血清(FBS)含量的DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ),加入Activin A、bFGF、IWR1(Axin蛋白的穩(wěn)定劑)以及Y27632(ROCK激酶的抑制劑)這四種細(xì)胞因子和小分子化合物,可以顯著提高mEpiSCs的存活能力。然而,Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培養(yǎng)條件由于涉及因子種類過多,不利于后續(xù)對細(xì)胞內(nèi)信號通路與調(diào)控機(jī)制的深入探究,且培養(yǎng)成本較高。我們在前期工作中嘗試對mEpiSCs的培養(yǎng)條件作進(jìn)一步改進(jìn)與優(yōu)化,最終得到僅添加IWR1和Y27632即可使mEpiSCs維持在自我更新狀態(tài)的最佳培養(yǎng)條件。為探究IWR1和Y27632維持mEpiSCs自我更新的作用機(jī)制,設(shè)計對照實驗,檢測IWR1條件下和Y27632條件下,mEpiSCs中各基因的差異化表達(dá)程度,并以此為基礎(chǔ),篩選出每種小分子可能作用的靶基因。考慮到課題周期的限制,我們首先選取IWR1作為研究對象,篩選出其在細(xì)胞中可能作用的下游靶基因為Foxd3,并利用另一種小分子CHIR99021與IWR1對于Wnt/β-catenin信號通路所具有的拮抗作用來設(shè)計反向?qū)嶒?證明了 Foxd3的表達(dá)與IWR1之間確實具有相關(guān)性。下一步,圍繞Foxd3來設(shè)計實驗,探究IWR1調(diào)控mEpiSCs自我更新狀態(tài)的中間媒介。相關(guān)實驗分兩個方向展開:其一,構(gòu)建包含目的基因的過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染并借此在細(xì)胞內(nèi)上調(diào)Foxd3的表達(dá)量,觀察其能否替代IWR1來維持細(xì)胞的自我更新狀態(tài);其二,利用shRNA干擾的方法,在mEpiSCs內(nèi)下調(diào)Foxd3的表達(dá)水平,觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)分化現(xiàn)象。在mEpiSCs中分別上調(diào)與下調(diào)Foxd3后,通過形態(tài)觀察、細(xì)胞計數(shù)、qRT-PCR、免疫熒光等實驗手段來檢測mEpiSCs的自我更新水平與生長情況。結(jié)果顯示,在缺乏IWR1的培養(yǎng)條件下,與對照組細(xì)胞相比,過表達(dá)Foxd3后的mEpiSCs能夠維持正常的形態(tài)特征,且生長速率明顯提高,qRT-PCR實驗可檢測到細(xì)胞內(nèi)自我更新標(biāo)志基因Esrrb、Nanog和Oct4的正常表達(dá),且代表不同胚層的分化基因,如Gata6、Mixl1和Nestin的表達(dá)量未出現(xiàn)變化,而在免疫熒光實驗中也可檢測到自我更新標(biāo)志基因Oct4和Nanog的蛋白表達(dá)產(chǎn)物,說明上調(diào)Foxd3的表達(dá)量,能夠替代IWR1的作用來維持mEpiSCs處于自我更新狀態(tài);另一方面,在IWR1存在的條件下,下調(diào)Foxd3后的mEpiSCs與對照組相比,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常,自我更新標(biāo)志基因Oct4和Nanog在轉(zhuǎn)錄與蛋白水平上的表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào),且內(nèi)胚層、中內(nèi)胚層與中胚層的標(biāo)志基因表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上升,說明下調(diào)Foxd3的表達(dá)量,能夠使IWR1維持mEpiSCs自我更新的作用失效。由此可以推斷Foxd3作為小分子IWR1的下游靶基因,在其調(diào)控mEpiSCs生長與內(nèi)部信號通路的過程中發(fā)揮著重要作用,是維持細(xì)胞自我更新狀態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該研究結(jié)果擴(kuò)大了目前人們對于維持mEpiSCs自我更新分子機(jī)制的理解,有利于后續(xù)對其展開進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用,同時可以為探究人胚胎干細(xì)胞以及其他種類多能性干細(xì)胞的自我更新機(jī)制提供線索。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q23

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Embryonic stem cells generated by nuclear transfer of human somatic nuclei into rabbit oocytes[J];Cell Research;2003年04期

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本文編號：1324636