本文關(guān)鍵詞：來自嗜熱子囊菌的耐熱重組木聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的異源表達　出處：《安徽醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的通過在巴斯德畢赤酵母中異源表達進一步提高嗜熱子囊菌木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。方法基于巴斯德畢赤酵母的密碼子使用偏倚優(yōu)化原嗜熱子囊菌木聚糖酶基因xyn A的基因序列。構(gòu)建重組質(zhì)粒p GAPZαA-xyn A、p PIC9K-xyn A,經(jīng)線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化入表達宿主畢赤酵母GS115中,構(gòu)建重組菌株。經(jīng)過含博萊霉素(zeocin)的YPD瓊脂板初篩后,抽提基因組篩選陽性轉(zhuǎn)化子。使用博來霉素濃度梯度YPD瓊脂平板復篩轉(zhuǎn)化子。采用硫酸銨沉淀、有機溶劑沉淀、離子交換柱層析、分子篩層析等方法分離、純化重組木聚糖酶。通過SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實驗確定重組木聚糖酶大小,利用高碘酸硝酸銀染色和Endo H酶處理檢測重組酶是否為糖蛋白及糖蛋白的類型。以失活的重組木聚糖酶Xyn A作對照,與重組木聚糖酶Xyn A同樣在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中42°C處理激光打印紙72h,檢測其脫墨效果。在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中高溫(70~80°C)酶解未處理的玉米芯,溫育36h后測定其糖化效果。結(jié)果密碼子優(yōu)化后的xyn A基因通過設(shè)計、合成,并且在巴斯德畢赤酵母中表達。篩選出在木聚糖瓊脂板中形成最大水解透明圈的菌株RX8,用于搖瓶發(fā)酵,并產(chǎn)生40U/ml的木聚糖酶活性。S-75型葡聚糖凝膠層析純化后的重組木聚糖酶比酶活最高,達到1053U/mg的木聚糖活性。通過SDS-PAGE凝膠電泳和酶譜實驗確定重組木聚糖酶大小為75k Da。高碘酸-硝酸銀染色法顯示該重組木聚糖酶為糖蛋白,其表觀分子量顯著高于其蛋白理論值,表明該重組木聚糖酶在表達的過程中發(fā)生了高度糖基化。重組木聚糖酶Xyn A的最適反應(yīng)條件為75°C和p H 8.0。該酶在100°C下保溫8h仍保持高于80%的酶活性。重組木聚糖酶在Tris-HCl緩沖液(p H8.0)中42°C處理激光打印紙72h的脫墨效果(247%)高于報道的芽孢桿菌木聚糖酶CKBx1D(200%)。其在高溫酶解過程(70~80°C)中對未處理的玉米芯保溫36h后的糖化效率7.44%。此外,該重組木聚糖酶在較寬的p H(4.0~10.0)范圍內(nèi)具有較好的酸堿耐受性和穩(wěn)定性。結(jié)論重組木聚糖酶Xyn A首次在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達,其重組木聚糖酶的耐熱性較原始木聚糖酶得到較大提高。較高的比酶活力和良好的熱穩(wěn)定性使該重組木聚糖酶具有較大的工業(yè)化應(yīng)用潛力及經(jīng)濟價值,也為其它耐熱木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q55

【參考文獻】

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1 楊浩萌;柏映國;李江;羅會穎;王亞茹;伍寧豐;范云六;姚斌;;木聚糖酶XYNB的N46D突變、表達及酶學性質(zhì)變化[J];中國生物化學與分子生物學報;2006年03期

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本文編號：1315485