本文關鍵詞：人參糖基轉移酶基因UGT-D-3OH-1的克隆及原核表達　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：人參作為人參屬植物的代表,在中國已有上千年的應用歷史,是傳統(tǒng)的名貴中草藥,為五加科多年生草本植物。人參皂苷是人參乃至人參屬植物的主要活性成分,存在于人參的根、莖、葉等部位。人參皂苷Rh2是一種具有很高藥用價值的單體人參皂苷,尤其在腫瘤的預防及治療方面有著廣泛的應用,但人參皂苷Rh2的生產工藝一直未取得突破。研究表明人參皂苷Rh2由一系列的代謝合成,經歷角鯊烯,2,3-氧化角鯊烯,達瑪烯二醇,原人參二醇,最終原人參二醇在糖基轉移酶UGT-D-3OH-1的催化作用下生成人參皂苷Rh2。目前原人參二醇已經可以通過發(fā)酵法實現工業(yè)化生產,本研究旨在利用現代分子生物學技術,構建糖基轉移酶UGT-D-3OH-1的原核表達工程菌,利用原核表達系統(tǒng)的高效表達特性,通過發(fā)酵法生產糖基轉移酶UGT-D-3OH-1,以實現用酶工程的方法轉化原人參二醇生成人參皂苷Rh2。本研究通過基因工程的方法,以實驗室繼代培養(yǎng)的人參發(fā)根為實驗材料,克隆得到了人參發(fā)根中的糖基轉移酶基因UGT-D-3OH-1,將該基因與原核表達載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別進行連接,得到的重組質粒再轉入宿主菌E.coli BL21(DE3),得到原核表達工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。工程菌經IPTG誘導表達,目的蛋白SDS-PAGE電泳檢測,包涵體復性,酶活測定,最終得到了具有酶活的目的蛋白,在體外以原人參二醇為底物通過酶催化反應生成人參皂苷Rh2,并進一步地對工程菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,為實現工業(yè)化生產人參皂苷Rh2奠定堅實的基礎。本研究的主要內容如下:(1)以培養(yǎng)了28d的人參發(fā)根為實驗材料,提取獲得了人參發(fā)根的總RNA,通過RT-PCR技術反轉錄出人參的c DNA,根據NCBI數據庫中已知的序列以及引入酶切位點的需求,設計UGT-D-3OH-1基因的特異性引物,再以c DNA為模板,最終成功克隆出了糖基轉移酶基因UGT-D-3OH-1。(2)將糖基轉移酶基因UGT-D-3OH-1與pMD18-T克隆載體相連接,構建得到的重組載體命名為pT-UGT,之后再將其轉化到大腸桿菌中JM109中,經過菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定,初步認定構建成功,進一步測序顯示成功構建了重組載體pT-UGT。(3)用BamHI和Sal I兩個酶對克隆載體pT-UGT和原核表達載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別進行酶切,使用T4 DNA連接酶將UGT-D-3OH-1基因與原核表達載體pET-22b(+)和pET-28a(+)分別相連接,構建了重組質粒pET-22b-UGT和pET-28a-UGT,通過測序驗證了載體上的目的基因序列正確。將兩種重組質粒分別轉化至E.coli BL21(DE3)中,最終構建了兩種原核表達工程菌BL21-UGT-22b和BL21-UGT-28a。(4)對構建成功的兩種工程菌分別進行培養(yǎng),經IPTG誘導表達后,通過SDS-PAGE檢測工程菌中目的蛋白的表達情況,結果表明目的蛋白在兩種工程菌中均有表達,都是以不可溶的包涵體形式表達,在工程菌BL21-UGT-22b中表達的目的條帶分子量約為50 KDa,比UGT-D-3OH-1的預測分子量少了5 KDa,在工程菌BL21-UGT-28a中表達的目的條帶與UGT-D-3OH-1的預測分子量一致,大小為55 KDa。(5)對工程菌BL21-UGT-28a中以包涵體形式表達的目的蛋白進行復性,復性后加入底物進行酶促反應,通過HPLC檢測到了反應產物人參皂苷Rh2,含量為6.657×10~(-3) mg/L,說明包涵體復性后具有了正常的酶活,酶活大小為1.78×10~(-4) U/m L。(6)從初始誘導OD600nm值,IPTG濃度,誘導時間,誘導溫度四個方面對工程菌BL21-UGT-28a的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,確定了最佳發(fā)酵條件為:初始誘導OD600nm值0.8,IPTG濃度0.1 m M,誘導時間6 h,誘導溫度37℃,在此條件下目的蛋白的表達量占菌體總蛋白表達量的比例為53.5%。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

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