本文關鍵詞：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Mof在向成骨細胞分化中的作用

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone MesenchymalStem Cells,BMSCs)是一種來自骨髓的多能干細胞,自我更新能力強,具有多向分化的潛能。體內(nèi)正常生長或體外定向誘導培養(yǎng)條件下,它可以向成骨細胞,軟骨細胞,脂肪細胞和肌肉細胞分化。骨髓間充質(zhì)干細胞的臨床應用包括骨缺損,軟骨退化的治療,肝臟、心臟等組織修復,新陳代謝相關疾病治療。在再生醫(yī)學與組織工程中其臨床應用價值很高。骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化有兩條主要的調(diào)控途徑,分別是TGF-β/BMPs信號通路和經(jīng)典Wnt信號通路。Bmp2作為BMPs家族中一個重要的亞型,它與來自Wnt信號通路中的β-catenin都具有上調(diào)向成骨細胞分化的關鍵基因Runx2,Osterix表達的功能,從而促進向成骨細胞分化。Mof即KAT8,作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族的成員,它具有MYST催化結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族往往隨機對組蛋白尾部賴氨酸進行乙�；�,Mof對組蛋白H4第16位的賴氨酸具有嚴格的底物特異性。Mof在許多以染色質(zhì)為基礎的生命活動中發(fā)揮調(diào)控作用,如胚胎發(fā)育、細胞分化、DNA損傷修復以及腫瘤發(fā)生。骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的這一過程,組蛋白乙�；{(diào)控發(fā)揮著重要功能。成骨分化相關蛋白Runx2在向成骨細胞分化進程中表達升高,這與H3K9的乙�；揎椇虷3K14的乙�；揎椨嘘P。HDAC8可以抑制H3K9乙�；蚏unx2活性,抑制成骨分化。組蛋白白去乙�；敢种苿┛梢源龠M向成骨細胞分化。了解Mof在向成骨細胞分化過程中發(fā)揮的作用將有重要的研究意義與臨床實用價值。研究目的:我們利用小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞ST2細胞,前成骨細胞MC3T3-E1細胞誘導向成骨細胞分化,分別通過堿性磷酸酶染色實驗,茜素紅染色實驗驗證,研究Mof在向成骨細胞分化過程中的表達變化情況。我們利用siRNA干擾Mof表達后,觀察向成骨細胞分化是否受到抑制。利用Western Blotting實驗和定量PCR(Q-PCR)技術檢測干擾Mof表達和過表達Mof后,Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白和RNA的表達變化情況。免疫共沉淀(Co-IP)實驗探究Mof和向成骨細胞分化相關蛋白之間的相互作用。研究方法:1.配制誘導向成骨細胞分化培養(yǎng)基培養(yǎng)ST2細胞,MC3T3-E1細胞從而誘導向成骨細胞分化,利用堿性磷酸酶染色實驗以及茜素紅染色實驗進行驗證。利用 Western Blotting 技術檢測 Mof、H4K16ac 以及 Bmp2、β-catenin、Runx2和Osterix在誘導向成骨細胞分化0天,3天,7天和14天的蛋白表達變化情況。2.在ST2細胞,MC3T3-E1細胞中利用siRNA干擾Mof的表達,觀察向成骨細胞分化是否在Mof的表達降低時受到抑制,利用WesternBlotting實驗和 Q-PCR 實驗觀察 Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 等在 Mof 表達降低時的表達變化。3.在ST2細胞,MC3T3-E1細胞中,瞬時轉(zhuǎn)染Flag-Mof質(zhì)粒,研究在過表達 Mof 時,Bmp2、β-catenin、Runx2 和 Osterix 的表達變化。4.利用Co-IP實驗方法觀察正常培養(yǎng)和誘導向成骨細胞分化培養(yǎng)情況下ST2細胞,MC3T3-E1細胞中,Mof與Runx2、Osterix和β-catenin的相互作用關系。5.在全身敲除Mof的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,利用HE染色方法觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。實驗結(jié)果:1.ST2細胞,MC3T3-E1細胞經(jīng)誘導向成骨細胞分化后,Mof蛋白的表達水平,H4K16乙�；诫S著天數(shù)增加逐漸升高。Bmp2、β-catenin、Runx2、Osterix的蛋白表達也升高。2.利用siRNA干擾Mof的表達后,向成骨細胞分化受到抑制。Bmp2、β-catenin的表達沒有明顯變化,Runx2、和Osterix的表達降低。3.過表達Mof后,Runx2和Osterix的蛋白表達升高。4.Co-IP實驗證明,Mof并不與β-catenin相互作用,但是和Runx2、Osterix相互作用。5.小鼠個體水平的研究發(fā)現(xiàn),全身敲除Mof后,骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化,可能誘導天數(shù)較短,表型變化并不明顯。結(jié)論:向成骨細胞分化過程中,Mof蛋白表達量升高。干擾Mof表達造成向成骨細胞分化受到抑制。Mof可以與Runx2、Osterix在蛋白水平上相互作用。實驗結(jié)果證明向成骨細胞分化這一過程中Mof具有重要的調(diào)控作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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本文編號：1302718