本文關(guān)鍵詞：Hr基因敲除小鼠的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的初步研究

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【摘要】：研究背景:無毛基因(Hairless,Hr)是一個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)并與毛發(fā)生長密切相關(guān)的一個(gè)基因,該基因編碼一個(gè)高表達(dá)于皮膚和腦部的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控甲狀腺受體的轉(zhuǎn)錄,基因產(chǎn)物作用于毛囊細(xì)胞,控制著毛囊細(xì)胞的增殖、分化與細(xì)胞凋亡之間的平衡,在毛囊中的表達(dá)具有周期性,從而影響毛發(fā)的生長周期轉(zhuǎn)換,無毛基因的缺失導(dǎo)致毛囊再生受到阻礙,引發(fā)形成一種復(fù)雜的皮膚表型[1-4]。無毛基因的突變是于1924年首次在小鼠身上被發(fā)現(xiàn)[5],無毛基因突變引發(fā)的小鼠的皮膚和被毛的形態(tài)發(fā)生異常,造成小鼠毛發(fā)脫落,但是Hr突變小鼠在出生后第一次的毛囊形成和毛發(fā)的表型都是正常的。目前對(duì)毛發(fā)生物學(xué)的研究,我們難以知道毛發(fā)的形態(tài)發(fā)生到底是怎樣的機(jī)制,哪些因子對(duì)毛發(fā)具有真正的調(diào)控作用。本課題通過構(gòu)建Hr基因敲除小鼠模型研究毛發(fā)生長脫落的作用機(jī)制,對(duì)基因的功能和蛋白質(zhì)表達(dá)水平方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,揭示出毛發(fā)的生長調(diào)控受相關(guān)基因表達(dá)水平變化的影響。研究方法:1.利用TALEN基因修飾技術(shù)構(gòu)建Hr基因敲除小鼠模型,提取子代小鼠DNA、PCR擴(kuò)增、測序、陽性鑒定,Hr基因敲除小鼠品系穩(wěn)定繁育;2.構(gòu)建成功的Hr基因敲除純合子小鼠作為主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察記錄不同日齡Hr基因敲除小鼠的形態(tài)學(xué)和皮膚組織學(xué)切片病理變化;3.取不同日齡的Hr基因敲除純合子小鼠和野生型小鼠的背部皮膚組織為實(shí)驗(yàn)材料,IHC法探究Hr突變基因在毛囊結(jié)構(gòu)中的表達(dá)部位,RT-PCR和Western blot法檢測mRNA和HR的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建兩種Hr基因敲除小鼠模型,第一種是Hr編碼序列的86-87位缺失兩個(gè)堿基GT,第二種敲除小鼠品系是88-89位點(diǎn)AC堿基缺失,本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)已穩(wěn)定繁育出這兩種Hr基因敲除品系小鼠,其遺傳特征遵循孟德爾遺傳定律。2.敲除純合子小鼠出生后約兩周,毛發(fā)從腹部開始脫落,頭部和背部毛發(fā)稀疏并逐漸脫凈,終生不再長毛,兩種敲除品系純合子小鼠的毛發(fā)表型相似,但是Hr基因敲除雜合子小鼠毛發(fā)表型正常;基因敲除純合子小鼠21日齡時(shí)的皮膚組織中毛囊結(jié)構(gòu)解體,28日齡皮下組織開始形成小的包囊結(jié)構(gòu),6月齡的小鼠皮膚組織中無規(guī)則排列著大小不等的包囊。3.通過IHC檢測HR的表達(dá)部位,結(jié)果顯示21日齡、28日齡、6月齡基因敲除小鼠毛發(fā)的皮膚組織中均明顯可見HR表達(dá),野生型小鼠僅處于休止期的毛囊結(jié)構(gòu)中有表達(dá),其它時(shí)期僅有少量表達(dá)。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測mRNA的表達(dá)量與Western blot檢測的蛋白表達(dá)水平一致,基因敲除小鼠(KO)與野生型小鼠(WT)出生后7天(P7)和21天Hr的表達(dá)差異不顯著(P0.05),14天KO的Hr的表達(dá)量明顯高于WT,差異顯著(P0.05),28天時(shí)KO的Hr表達(dá)與21天相比無明顯變化,28天時(shí)WT的Hr表達(dá)量顯著低于KO(P0.05)。敲除純合子小鼠皮膚組織中Hr在脫毛期均高水平表達(dá),而野生型小鼠的毛囊結(jié)構(gòu)僅處在毛發(fā)休止期時(shí)表達(dá)較高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知Hr的表達(dá)水平調(diào)控毛發(fā)的生長發(fā)育機(jī)制。研究結(jié)論:1.Hr基因的敲除可以導(dǎo)致毛發(fā)生長異常,構(gòu)建的Hr基因敲除小鼠遺傳背景比較清楚,可以被用來作為研究某些皮膚疾病、毛發(fā)疾病及其衰老機(jī)制的動(dòng)物模型。2.Hr敲除小鼠毛發(fā)脫落的皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的病理變化,在脫發(fā)階段小鼠的毛囊結(jié)構(gòu)退化瓦解;Hr基因正常功能的缺失導(dǎo)致毛囊重新形成過程受阻,引起毛發(fā)生長異常。3.HR的表達(dá)參與調(diào)控毛發(fā)的生長發(fā)育機(jī)制,Hr突變體小鼠皮膚組織中HR高表達(dá)引起小鼠毛發(fā)脫落,通過本課題的研究為現(xiàn)代人類面臨的脫發(fā)癥、斑禿等毛發(fā)疾病的病因及其分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)材料和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1281600