本文關鍵詞：重組蛛絲蛋白的二級結構及成絲機理研究

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【摘要】：蛛絲蛋白纖維作為一種優(yōu)異的生物學材料,在生物醫(yī)學工程領域具有極大的潛在應用價值,已有研究表明,重組蛛絲蛋白可用作血管、神經導管及藥物載體等。目前重組蛛絲蛋白的研究主要集中于牽引絲、次壺腹腺絲及鞭毛狀腺絲蛋白質。缺少梨狀腺絲蛋白(Pyriform Spidroin,PySp)的研究,尤其是大腹園蛛(A.ventricosus)梨狀腺絲蛋白的編碼序列至今仍未有報道,其生物學功能仍有待研究。為了解析大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復區(qū)(Rp)的功能、研究C端非重復區(qū)(CT)對成絲機理的影響、測試梨狀腺絲素蛋白的力學性能、獲得一種材料學性能優(yōu)良的重組蛛絲蛋白、為蛛絲蛋白的仿生提供理論依據,本課題開展了以下幾個方面的研究工作并都取得了較理想的研究結果。(1)以本實驗室前期構建的大腹園蛛基因組為模板,設計特異性引物,克隆獲得一段蛛絲蛋白編碼序列,通過Blast比對分析,確定該序列包含大腹園蛛梨狀腺絲(Piriform spidroin,PySp)的一段完整重復區(qū)(Rp)的編碼序列,該序列為A.ventricosus的首條完整的PySp重復區(qū)基因序列,填補了國內A.ventricosus絲蛋白編碼基因克隆的空白,為絲蛋白基因的研究增填了新成員。(2)將PySp-Rp模塊與MiSp-NT/CT模塊重組構建不具有CT功能模塊的MiSpNT-PySp Rp與具有完整功能模塊的MiSpNT-PySp Rp-MiSpCT重組蛛絲蛋白表達載體,進行蛋白質表達和純化,并且優(yōu)化兩種蛋白的表達產量。經過SDS-PAGE膠和Western-blot鑒定,兩種重組蛛絲蛋白均能在大腸桿菌中表達,表達產量較高,形成包涵體,經過變性純化,獲得了純度較高的重組蛛絲蛋白。(3)采用圓二色譜(Circular dichroism,CD)測定不同pH下兩種重組蛛絲蛋白溶液的二級結構,計算各二級結構百分含量的變化;使用傅里葉紅外光譜(ATR-FTIR)測定兩種重組蛛絲蛋白凍干后的紅外光譜,計算其酰胺Ⅰ帶的各二級結構百分含量。比較兩種蛛絲蛋白的二級結構組成發(fā)現,隨著p H值降低,CT結構域會引發(fā)PySp二聚化促進其成絲;紅外光譜顯示,CT結構域會增加PySp纖維的β折疊的百分含量,揭示了C端非重復區(qū)的存在可促進絲素蛋白質的組裝成絲,有利于提高固著絲纖維機械性能。(4)使用掃描電鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察濕紡獲得的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維的表面形態(tài),顯示濕紡形成的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重組蛛絲蛋白纖維表面整體光滑,直徑整體均勻,類似于天然蛛絲纖維形態(tài),直徑較天然蛛絲略粗,大約為20 um左右。綜上所述,本課題不僅填補了大腹園蛛梨狀腺絲蛋白重復區(qū)編碼基因的空白,同時以該基因為基礎,進一步深入研究了CT對蛛絲蛋白成絲機理的作用機制,后續(xù)還需要通過增加剪切力等條件進一步探索該重組蛛絲纖維的力學性能。本研究為今后重組蛛絲蛋白的仿生提供了新的理論基礎。
【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q51

【參考文獻】

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本文編號：1268350