發(fā)布時(shí)間：2021-07-02 08:47

　　自二十世紀(jì)五十年代以來(lái)，有機(jī)磷化合物已被廣泛地用于農(nóng)用殺蟲(chóng)劑。由于有機(jī)磷化合物能不可逆抑制動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶，破壞神經(jīng)傳遞，因此對(duì)人及家畜等脊椎動(dòng)物具有極強(qiáng)的毒副作用。由于殺蟲(chóng)劑的過(guò)量和連續(xù)使用，許多地區(qū)土地、水生態(tài)系統(tǒng)被有機(jī)磷化合物污染，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅。目前去除有機(jī)磷污染物的方法（漂白處理、堿水解、焚燒或填埋處理等）反應(yīng)條件劇烈、副產(chǎn)物具有毒性及腐蝕性，限制了廣泛應(yīng)用。微生物來(lái)源的磷酸三酯酶（PTE, EC3.1.8.1）可以廣泛水解有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，具有環(huán)保和原位解毒優(yōu)勢(shì)，提供了生物修復(fù)新途徑。由于磷酸三酯酶均來(lái)源于常溫微生物，較低的生物學(xué)穩(wěn)定性限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，應(yīng)用生物技術(shù)手段，研發(fā)生物學(xué)穩(wěn)定性好、廣譜、高效的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑降解酶勢(shì)在必行。通過(guò)檢索細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)嗜熱細(xì)菌Geobacillus kaustophilus HTA426基因組DNA中含有一個(gè)磷酸三酯酶（命名為GkaP）編碼序列GK1506（GenBank ID:3183579），我們對(duì)該基因進(jìn)行了異源表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)、催化機(jī)制及分子進(jìn)化等方面開(kāi)展了系統(tǒng)研究。重組GkaP具有優(yōu)異... 

【文章來(lái)源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：115 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 有機(jī)磷化合物及其神經(jīng)毒性
    1.2 細(xì)菌磷酸三酯酶
        1.2.1 底物特異性和立體選擇性
        1.2.2 X-ray 結(jié)構(gòu)
        1.2.3 催化機(jī)理
        1.2.4 磷酸三酯酶的潛在應(yīng)用
    1.3 磷酸三酯酶的趨異進(jìn)化
    1.4 蛋白質(zhì)工程簡(jiǎn)介
        1.4.1 蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)
            1.4.1.1 底物特異性與立體選擇性的改造
            1.4.1.2 活力改造
            1.4.1.3 穩(wěn)定性改造
            1.4.1.4 酶分子結(jié)構(gòu)元件嫁接
        1.4.2 蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)
            1.4.2.1 易錯(cuò) PCR (error-prone PCR)
            1.4.2.2 同源基因重組 (homology-dependent gene recombination)
        1.4.3 蛋白質(zhì)的半理性設(shè)計(jì)
            1.4.3.1 特定區(qū)域的隨機(jī)突變
            1.4.3.2 隨機(jī)突變后的定點(diǎn)飽和突變
            1.4.3.3 計(jì)算機(jī)輔助的半理性設(shè)計(jì)
    1.5 分子進(jìn)化類(lèi)磷酸三酯的酶內(nèi)酯酶
    1.6 其它有機(jī)磷水解酶類(lèi)
        1.6.1 二異丙基氟磷酸酯酶 (diisopropylfluorophosphatase, DFPases)
        1.6.2 血清對(duì)氧磷酶 (Serum paraoxonase, PON)
        1.6.3 有機(jī)磷酸酸酐水解酶 (Organophosphorus acid anhydrolase, OPAA)
        1.6.4 甲基對(duì)硫磷水解酶 (Methyl parathion hydrolase, MPH)
    1.7 立題依據(jù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
    1.8 參考文獻(xiàn)
第二章 嗜熱磷酸三酯酶基因的克隆、表達(dá)及工程菌構(gòu)建
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要儀器
        2.2.4 培養(yǎng)基
        2.2.5 使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 Geobacillus kaustophilus HTA426 的復(fù)蘇及培養(yǎng)
        2.3.2 G. kaustophilus HTA426 基因組 DNA 的提取
        2.3.3 來(lái)源于嗜熱細(xì)菌 G. kaustophilus HTA426 的磷酸三酯酶基因的克隆
            2.3.3.1 引物設(shè)計(jì)
            2.3.3.2 GK1506 基因的 PCR 擴(kuò)增
            2.3.3.3 GK1506 的酶切和純化
            2.3.3.4 pET-28a 載體制備
            2.3.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.3.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.3.3.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.3.8 陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定
        2.3.4 GK1506 基因的預(yù)表達(dá)
        2.3.5 GkaP 的分離純化
        2.3.6 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 同源序列比對(duì)及進(jìn)化關(guān)系分析
        2.4.2 磷酸三酯酶 GK1506 基因的 PCR 擴(kuò)增
        2.4.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定
        2.4.4 目的蛋白的表達(dá)和純化
    2.5 小結(jié)
    2.6 參考文獻(xiàn)
第三章 GkaP 的酶學(xué)性質(zhì)
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 酶活力測(cè)定方法
            3.2.2.1 磷酸三酯酶活力測(cè)定方法
            3.2.2.2 內(nèi)酯酶活力測(cè)定方法
            3.2.2.3 羧酸酯酶活力測(cè)定方法
        3.2.3 最適溫度和熱穩(wěn)定性測(cè)定
        3.2.4 最適 pH 和 pH 穩(wěn)定性測(cè)定
        3.2.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定
        3.2.6 不同的二價(jià)金屬離子取代對(duì)酶活性的影響
        3.2.7 金屬螯合劑、有機(jī)溶劑及去污劑對(duì) GkaP 活力的影響
        3.2.8 蛋白的金屬含量測(cè)定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 GkaP 的最適溫度和熱穩(wěn)定性
        3.3.2 GkaP 的最適 pH 和 pH 穩(wěn)定性
        3.3.3 GkaP 的催化“非專(zhuān)一性”
        3.3.4 不同的二價(jià)離子構(gòu)建的 GkaP 對(duì)酶活力的影響
        3.3.5 GkaP 的金屬含量分析
        3.3.6 金屬螯合劑、有機(jī)溶劑及去污劑對(duì) GkaP 活力的影響
    3.4 小結(jié)
    3.5 參考文獻(xiàn)
第四章 GkaP 活性中心附近熱點(diǎn)氨基酸的突變體設(shè)計(jì)與功能研究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 同源序列比對(duì)
        4.2.2 定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變
        4.2.3 飽和突變庫(kù)的篩選
        4.2.4 野生型 GkaP 及其突變體的表達(dá)、純化
        4.2.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定
        4.2.6 野生型 GkaP 及其突變體對(duì)各種殺蟲(chóng)劑的比活力測(cè)定
        4.2.7 底物的分子對(duì)接
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 GkaP 的 Tyr~(99)和 Arg~(230)位點(diǎn)飽和突變庫(kù)的構(gòu)建和篩選
        4.3.2 突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)分析
        4.3.3 突變體對(duì)于幾種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的比活力
        4.3.4 GkaP 突變體活力變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
    4.4 小結(jié)
    4.5 參考文獻(xiàn)
第五章 GkaP 的分子進(jìn)化—提高對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的降解活力
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 定點(diǎn)突變和定點(diǎn)飽和突變
        5.2.2 全基因易錯(cuò) PCR 突變庫(kù)的構(gòu)建
        5.2.3 突變庫(kù)篩選
        5.2.4 突變體的表達(dá)和純化
        5.2.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)和各種殺蟲(chóng)劑比活力測(cè)定方法
        5.2.6 突變體的熱穩(wěn)定性、最適溫度和 pH 測(cè)定
        5.2.7 突變體的同源建模
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 GkaP 的進(jìn)化策略
        5.3.2 突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)分析
        5.3.3 突變體的熱穩(wěn)定性分析
        5.3.4 突變體的生化性質(zhì)表征 (最適溫度和最適 pH)
        5.3.5 突變體對(duì)不同有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的比活力
        5.3.6 突變位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析
    5.4 小結(jié)
    5.5 參考文獻(xiàn)
創(chuàng)新點(diǎn)
展望
作者簡(jiǎn)歷
攻讀博士期間發(fā)表成果
參與的科研課題
致謝



本文編號(hào)：3260145