發(fā)布時(shí)間：2021-03-17 11:34

　　海州香薷（Elsholtzia splendens）為唇形科香薷屬一年生草本植物,對(duì)銅有較高的耐性和累積能力,被鑒定為銅耐性/富集植物。近年來,利用海州香薷進(jìn)行Cu污染土壤的修復(fù)研究及海州香薷對(duì)銅吸收累積與耐性解毒的分子機(jī)理研究受到廣大生物和環(huán)境科學(xué)學(xué)者的關(guān)注。本論文以海州香薷為材料,采用水培試驗(yàn),運(yùn)用cDNA-AFLP、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、SDS-PAGE、2D-PAGE、MALDI-TOF MS和LTQ-ESI-MS/MS等技術(shù),研究高銅和缺銅脅迫對(duì)海州香薷轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的影響,首次從轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的水平闡釋了海州香薷對(duì)銅吸收累積與耐性解毒的分子機(jī)理。此外,還應(yīng)用SMART技術(shù)構(gòu)建了海州香薷高銅和缺銅脅迫的全長(zhǎng)cDNA文庫,為開展海州香薷功能基因組學(xué)研究提供了寶貴資源。主要研究結(jié)果如下:1、海州香薷高Cu、缺Cu脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中,采用cDNA-AFLP技術(shù)篩選海州香薷根尖（約3～5cm）基因在缺銅（0μmol/L CuSO₄）和高銅（100βmol/L CuSO₄）處理期間,四個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0h、3h、6h和24h）... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：187 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 植物對(duì)土壤重金屬的吸收與累積機(jī)理
        1.1.1 植物可吸收的重金屬形態(tài)
        1.1.2 植物對(duì)根際土壤重金屬的活化
        1.1.3 植物對(duì)重金屬的吸收
        1.1.4 重金屬在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.1.5 重金屬在植物體內(nèi)的分配與貯存
        1.1.6 重金屬跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的吸收累積機(jī)制
    1.2 植物對(duì)重金屬的耐性與解毒機(jī)理
        1.2.1 細(xì)胞壁與重金屬結(jié)合
        1.2.2 重金屬的外排
        1.2.3 重金屬的區(qū)室化作用
        1.2.4 對(duì)重金屬的絡(luò)合作用
        1.2.5 重金屬耐性相關(guān)蛋白
    1.3 植物對(duì)Cu的吸收解毒機(jī)理研究進(jìn)展
        1.3.1 植物對(duì)Cu的吸收
        1.3.2 銅在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)
        1.3.3 銅缺乏對(duì)植物的影響
        1.3.4 銅過量對(duì)植物的毒害
        1.3.5 銅污染土壤的植物修復(fù)
    1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其在環(huán)境科學(xué)中的研究進(jìn)展
        1.4.1 cDNA-AFLP技術(shù)原理與方法
        1.4.2 cDNA-AFLP技術(shù)特點(diǎn)
        1.4.3 cDNA-AFLP技術(shù)及其在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用
    1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)及其在環(huán)境科學(xué)中的研究進(jìn)展
        1.5.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念
        1.5.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和技術(shù)手段
            1.5.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法
            1.5.2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段
        1.5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境科學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展
            1.5.3.1 環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究簡(jiǎn)要的發(fā)展過程
            1.5.3.2 微生物的環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            1.5.3.3 植物的環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            1.5.3.4 水生物的環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            1.5.3.5 無脊椎生物的環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)研究
        1.5.4 展望
    1.6 cDNA文庫
        1.6.1 cDNA文庫的種類
        1.6.2 SMART法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA文庫
        1.6.3 cDNA文庫質(zhì)量的評(píng)價(jià)
    1.7 論文立題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容
        1.7.1 立題依據(jù)
        1.7.2 研究?jī)?nèi)容
        1.7.3 技術(shù)路線
        1.7.4 創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 海州香薷Cu調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
    引言
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 所用主要試劑和培養(yǎng)基
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 海州香薷材料準(zhǔn)備
            2.2.1.1 海州香薷培養(yǎng)
            2.2.1.2 海州香薷脅迫處理
            2.2.1.3 取樣
        2.2.2 海州香薷總RNA的提取
        2.2.3 總RNA檢測(cè)
        2.2.4 mRNA純化
        2.2.5 cDNA-AFLP
            2.2.5.1 第一鏈cDNA合成
            2.2.5.2 第二鏈cDNA合成:采用LD-PCR擴(kuò)增法
            2.5.5.3 用QIAquick PCR Purification Kit純化雙鏈cDNA
            2.2.5.4 cDNA酶切
            2.2.5.5 連接反應(yīng)
            2.2.5.6 預(yù)擴(kuò)增
            2.2.5.7 選擇性擴(kuò)增
            2.2.5.8 測(cè)序膠電泳
            2.2.5.9 測(cè)序膠銀染
            2.2.5.10 DNA-AFLP差異片段的克隆
        2.2.6 序列比較及基因功能分析
        2.2.7 cDNA-AFLP片段的Real Time-PCR驗(yàn)證
            2.2.7.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物與熒光探針合成
            2.2.7.2 Real Time-PCR模板準(zhǔn)備
            2.2.7.3 Real Time-PCR反應(yīng)
            2.2.7.4 Real Time-PCR結(jié)果處理
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 總RNA的分離和質(zhì)量檢測(cè)
        2.3.2 cDNA-AFLP
            2.3.2.1 ds-cDNA的合成
            2.3.2.2 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
            2.3.2.3 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)
            2.3.2.4 選擇性擴(kuò)增差異條帶的回收克隆與測(cè)序鑒定
            2.3.2.5 差異條帶序列分析與比較
        2.3.3 TDF的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證
        2.3.4 Cu誘導(dǎo)基因的表達(dá)模式
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 海州香薷Cu調(diào)節(jié)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    引言
    3.1 海州香薷雙向電泳技術(shù)的研究
        3.1.1 材料與方法
            3.1.1.1 植物材料準(zhǔn)備
            3.1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
            3.1.1.3 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作
            3.1.1.4 蛋白質(zhì)的提取方法
            3.1.1.5 蛋白樣品制備
            3.1.1.6 Bradford法蛋白定量
            3.1.1.7 總蛋白的純化
            3.1.1.8 固相pH梯度雙向凝膠電泳（IPG-2D-PAGE）
            3.1.1.9 銀染（Yan et al.2000）
            3.1.1.10 圖像采集與分析
        3.1.2 結(jié)果與分析
            3.1.2.1 海州香薷蛋白提取方法篩選
            3.1.2.2 IPG（Immobilized pH gradeient）膠條pH值的選擇
        3.1.3 討論
        3.1.4 小結(jié)
    3.2 海州香薷高銅脅迫下的蛋白質(zhì)組研究
        3.2.1 材料與方法
            3.2.1.1 植物材料準(zhǔn)備
            3.2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作
            3.2.1.3 海州香薷銅含量的測(cè)定方法
            3.2.1.4 海州香薷蛋白提取純化方法
            3.2.1.5 SDS-PAGE電泳
            3.2.1.6 考馬斯亮蘭染色
            3.2.1.7 固相pH梯度雙向凝膠電泳
            3.2.1.8 銀染
            3.2.1.9 圖像采集與分析
            3.2.1.10 蛋白的膠內(nèi)胰酶消化
            3.2.1.11 質(zhì)譜鑒定
            3.2.1.12 數(shù)據(jù)庫的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定
        3.2.2 結(jié)果與分析
            3.2.2.1 海州香薷對(duì)銅的吸收
            3.2.2.2 海州香薷根、葉銅脅迫蛋白的SDS-PAGE分析
            3.2.2.3 銅脅迫處理?xiàng)l件下海州香薷根、葉蛋白的2-DE分析
            3.2.2.4 根系差異蛋白的基因本體論分析
        3.2.3 討論
        3.2.4 小結(jié)
    3.3 海州香薷缺銅脅迫下的蛋白質(zhì)組研究
        3.3.1 材料與方法
            3.3.1.1 植物材料準(zhǔn)備
            3.3.1.2 其它方法見3.2。
        3.3.2 結(jié)果與分析
            3.3.2.1 海州香薷缺Cu處理時(shí)根葉的銅含量
            3.3.2.2 海州香薷根、葉銅脅迫蛋白的SDS-PAGE分析
            3.3.2.3 缺銅脅迫處理?xiàng)l件下海州香薷根、葉蛋白的2D-PAGE分析
            3.3.2.4 根系差異蛋白的基因本體論分析
        3.3.3 討論
        3.3.4 小結(jié)
    3.4 總結(jié)
第四章 海州香薷缺Cu和高Cu脅迫根cDNA文庫的構(gòu)建
    引言
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 所用主要試劑和培養(yǎng)基
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 海州香薷材料準(zhǔn)備
            4.2.1.1 海州香薷培養(yǎng)
            4.2.1.2 海州香薷脅迫處理
            4.2.1.3 取樣
        4.2.2 海州香薷總RNA的提取
        4.2.3 總RNA檢測(cè)
        4.2.4 mRNA純化
        4.2.5 cDNA文庫構(gòu)建
            4.2.5.1 第一鏈cDNA合成
            4.4.5.2 第二鏈cDNA合成
            4.2.5.3 蛋白酶K消化
            4.2.5.4 限制性內(nèi)切酶Sfi Ⅰ消化雙鏈cDNA
            4.2.5.5 用CHROMA SPINTM-400對(duì)cDNA進(jìn)行分級(jí)分離
            4.2.5.6 cDNA與載體λTripIEx2的連接
            4.2.5.7 連接產(chǎn)物的包裝
        4.2.6 cDNA文庫質(zhì)量鑒定
            4.2.6.1 文庫滴度測(cè)定
            4.2.6.2 文庫插入片段大小以及重組率
        4.2.7 原始文庫的擴(kuò)增與保存
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 總RNA的分離和質(zhì)量檢測(cè)
        4.3.2 cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè)
            4.3.2.1 ds-cDNA的合成
TM-400分級(jí)">            4.3.2.2 鏈cDNA的CHROMA SPIN^TM-400分級(jí)
            4.3.2.3 cDNA與載體λTripIEx2的連接效率及文庫滴度測(cè)定
            4.3.2.4 cDNA文庫插入片段大小及重組率
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 主要研究結(jié)論與展望
    5.1 主要研究結(jié)論
        5.1.1 海州香薷對(duì)缺銅、高銅脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
        5.1.2 海州香薷對(duì)缺銅、高銅脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            5.1.2.1 海州香薷雙向電泳技術(shù)的研究
            5.1.2.2 海州香薷高銅脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            5.1.2.3 海州香薷缺銅脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
            5.1.2.4 小結(jié)
        5.1.3 海州香薷缺銅、高銅脅迫全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建
    5.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    5.3 研究展望
參考文獻(xiàn)
圖目錄
Index of figures
表目錄
Index of tables
附攻讀博士期間發(fā)表及撰寫的文章


【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3087067