環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是一類存在于自然水環(huán)境中的具有類激素效應的化學物質,可對生物體的免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾效應。由于水體中的EDCs直接暴露魚類,使得魚類比其他的陸生動物遭受更加強烈的影響。EDCs可引發(fā)魚體的生殖退化,甚至造成性別逆轉。目前,已在部分地區(qū)的魚群中發(fā)現(xiàn)雄魚生殖特征雌性化的現(xiàn)象。除此之外,EDCs亦可干擾魚類的能量代謝。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,魚類的代謝性疾病十分普遍,尤其體現(xiàn)在魚體的脂肪過度沉積,包括脂肪肝和腹腔脂肪嚴重沉積等。這不僅危害魚類自身的健康,降低魚類的抗應激能力,同時還會降低水產(chǎn)品品質,增加食品安全風險。但是,EDCs是如何干擾魚類的脂代謝,以及EDCs對魚類的脂代謝影響是否亦存在性別差異,該方面尚無研究。并且,EDCs對人類亦可造成癌癥和畸形等不利的健康損傷。而人體攝入的EDCs大部分來自于對魚類的消費和攝入。但是,當前魚體的EDCs對消費者人類造成的健康風險如何至今尚無詳細報道。因此,本論文旨在探究EDCs對魚類脂代謝的性別二態(tài)作用及其生物學分子機制,并評估EDCs通過魚類對消費人群造成的健康風險。本工作采用脂質組成分析、實時熒光定量PCR、蛋白印跡、轉錄組學分析、固相萃取、加壓液相萃取和組織學分析等技術手段,首先以斑馬魚(Danio rerio)作為的研究對象,探究兩種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雌二醇(E2)和雙酚A(BPA)對斑馬魚脂代謝所產(chǎn)生的性別二態(tài)性影響及其分子機制。隨后以養(yǎng)殖魚類-大黃魚(Pseudosciaena crocea)、羅非魚(Oreochromis niloticus)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)作為研究對象,通過對不同魚體EDCs的檢測和分析,評估其對魚類消費人群的健康危害風險,并追蹤EDCs進入養(yǎng)殖魚體的主要傳遞載體和途徑。論文的主要結果和結論如下:1.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對魚類脂代謝的性別二態(tài)影響及其生物學機制在探究E2和BPA對魚類的脂代謝性別二態(tài)影響之前,首先要確定雌雄魚之間的脂代謝是否存在性別差異。采用脂肪含量為1%、7%和13%的飼料分別投喂雌雄斑馬魚6周,并對雌雄斑馬魚的脂質組成和脂代謝調控進行比較。結果表明,在同一種飼料處理下,雌魚的總脂肪和肝臟中的甘油三酯(TG)含量顯著高于雄魚。并且,雄魚的總脂肪和各組織中的TG含量,在不同的飼料處理組間比較穩(wěn)定。而雌魚的總脂肪和TG含量,在不同的飼料處理組中差異顯著,尤其體現(xiàn)在高脂飼料處理組中。肝臟轉錄組的結果顯示,雌雄斑馬魚的脂代謝通路差異明顯。雌魚肝臟中脂肪合成相關基因:乙酰輔酶A羧化酶(acc)、固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(srebp-1c)和脂肪酸合成酶(fasn)表達量顯著高于雄魚。以上研究結果表明,雌雄魚之間的脂質組成和脂代謝調控模式存在顯著差異。為了選取合適的E2和BPA暴露劑量,在正式實驗開始之前,本研究先進行暴露濃度的篩選實驗。基于前期發(fā)現(xiàn)雄魚的脂代謝較為穩(wěn)定,因此,選擇雄斑馬魚進行E2和BPA的暴露濃度篩選實驗。在正常脂肪含量飼料投喂下,采用不同梯度濃度的E2和BPA暴露雄斑馬魚6周。以E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)作為低濃度處理組,E2(2000 ng/L)和BPA(2000μg/L)作為高濃度處理組,探究不同濃度的E2和BPA對魚體脂代謝的影響。所有E2和BPA處理組均可顯著地提高斑馬魚的生長,破壞其精巢結構,抑制精子發(fā)育,并誘導雄魚的生殖系統(tǒng)發(fā)生雌性化的現(xiàn)象。同時,與對照組和高濃度E2和BPA處理組相比,低濃度處理組可顯著改變魚體的脂質組成和脂代謝模式,促進魚體的總脂肪,以及肝臟中的TG和游離脂肪酸(FFA)發(fā)生積累。以上研究結果表明,E2和BPA對魚的脂代謝影響具有顯著的濃度依賴效應。濃度篩選實驗顯示,E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)暴露濃度對斑馬魚的脂代謝可產(chǎn)生顯著性影響。因此,為了深入探究E2和BPA對魚類脂代謝的性別二態(tài)影響及其生物學分子機制,選擇E2(200 ng/L)和BPA(100μg/L)分別暴露雌雄斑馬魚6周,同時增設雌激素受體抑制劑他莫昔芬(TAM)暴露組。研究結果發(fā)現(xiàn),E2和BPA主要通過提高雄魚體內(nèi)脂肪合成基因的表達,進而顯著地增加魚體的總脂肪和肝臟中的TG含量,使得雄魚的脂肪含量接近于雌魚。同時,E2和BPA暴露后的雄魚的脂代謝調控模式,與對照組雄魚的脂代謝調控模式之間差異顯著,而與對照組雌魚的脂代謝調控模式相似度極高。這表明,E2和BPA暴露后雄魚的脂代謝調控出現(xiàn)雌性化的表征。脂代謝相關蛋白的表達結果顯示,E2和BPA可抑制腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)蛋白活性,從而降低AMPK通路下游的脂肪分解相關基因的表達。同時,被抑制的AMPK蛋白亦可激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和SREBP-1c通路,并進一步啟動脂肪合成基因fasn和acc的轉錄與表達。除此之外,E2和BPA亦可通過抑制信號轉導和轉錄激活子3(STAT3)蛋白的表達,促進下游srebp-1c的基因轉錄。以上研究結果表明,E2和BPA主要通過抑制AMPK蛋白的表達激活mTOR/SREBP-1c的脂肪合成相關通路,提高雄魚的脂肪積累,最后導致雄魚的脂代謝調控模式趨于雌性。2.養(yǎng)殖魚體環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對消費人群的健康風險評估由于人們?nèi)粘Ｉ钪械聂~類供應主要來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖,因此,本部分工作選擇養(yǎng)殖魚類開展魚體EDCs對人類健康的風險評估。首先評估自然水環(huán)境中的E2和BPA,通過養(yǎng)殖魚大黃魚對人體的健康風險。我們使用等脂不等糖的配合飼料在我國象山海域養(yǎng)殖大黃魚8周,以此建立兩種體脂含量不同的養(yǎng)殖魚模型。通過檢測魚體的脂肪含量及E2和BPA的積累水平,探究不同能量含量的飼料對養(yǎng)殖魚的生長和體內(nèi)污染物蓄積的影響,并評估實際養(yǎng)殖魚體BPA含量對人體的健康風險。結果顯示,高能飼料處理組中全魚、肌肉和肝臟中的脂肪含量顯著高于低能飼料處理組。兩個不同飼料處理組魚體的E2濃度沒有呈現(xiàn)顯著性差異,但BPA在高能飼料處理組魚體的濃度具有高于低能飼料處理組的趨勢。雖然本研究中,大黃魚體內(nèi)積累的BPA并不會對人體產(chǎn)生健康危害。但高能飼料處理組魚體的BPA對人體產(chǎn)生的健康風險,仍然具有高于低能飼料處理組的趨勢,這表明飼料組成可影響環(huán)境污染物在養(yǎng)殖魚體內(nèi)的積累濃度,進而影響其對人體造成的健康危害風險�；谏鲜龃簏S魚的研究結果,為了深入探究飼料成分對養(yǎng)殖魚體EDCs積累的影響,以及EDCs在不同種類養(yǎng)殖魚體的沉積差異,我們在本領域首次開展了EDCs“從海洋到餐桌”的全養(yǎng)殖鏈追蹤。本研究從我國渤海和黃海捕撈一批鳀魚,送至兩家粗制魚油加工廠制得粗制魚油,再將兩種粗制魚油送至精煉魚油加工廠制得精煉魚油。再以三種魚油作為飼料中主要的脂肪源,制得含有三種不同魚油的飼料,分別為粗制魚油1號飼料、粗制魚油2號飼料和精煉魚油飼料。使用三種飼料分別養(yǎng)殖羅非魚(lean fish,瘦魚)和黃顙魚(oily fish,油魚)8周,對魚的生長和營養(yǎng)指標,及肌肉中的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物DDTs、PCBs和二噁英進行檢測分析。研究發(fā)現(xiàn),黃顙魚和羅非魚的生長和營養(yǎng)組成顯著不同,黃顙魚的脂肪含量顯著高于羅非魚,但其增重、飼料效率和蛋白含量顯著地低于羅非魚。并且,黃顙魚肌肉中的DDTs、PCBs和二噁英含量亦顯著高于羅非魚,同時,黃顙魚體內(nèi)EDCs對人體產(chǎn)生的健康風險高于羅非魚。這說明養(yǎng)殖魚的種類可影響魚體EDCs的蓄積濃度,進而影響其對人體造成的健康危害風險。通過分析養(yǎng)殖水體、飼料成分、魚油和養(yǎng)殖魚體的EDCs組成模式圖發(fā)現(xiàn),魚體的EDCs主要來自于飼料中的魚油成分,這表明魚油是海洋EDCs進入養(yǎng)殖魚體的重要傳遞載體。并且,粗制魚油組魚體的EDCs含量顯著高于精煉魚油組魚體的EDCs含量,這說明魚油的加工技術亦可影響?zhàn)B殖魚體內(nèi)的EDCs積累濃度。上述研究結果表明,通過減少粗制魚油的使用,提高養(yǎng)殖魚的生長和飼料效率,可有效地降低環(huán)境中EDCs對魚類消費人群造成的健康危害風險。本研究論文立足于當前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的問題和挑戰(zhàn),以及魚類消費人群的所可能面臨的健康隱患,較為全面而深入地闡明環(huán)境污染物對魚類代謝性疾病和人類健康的影響,為準確評價當前的環(huán)境健康與水產(chǎn)品品質提供基礎數(shù)據(jù)。同時,本研究首次追蹤海洋EDCs通過飼料魚油,傳遞至養(yǎng)殖魚體,最終進入人體這一傳輸路徑。為保障水產(chǎn)品的綠色安全,并提高魚類消費人群的身體健康素質提供重要的參考依據(jù)。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：X503.225;X820.4
【部分圖文】：

POPs 暴露亦可對魚體脂質代謝產(chǎn)生影響。如用 0.1、0.2、0.5 和 1 mg/L 殺蟲劑Aldrin 分別暴露胡子鯰(Clarias batrachus L.) 12、60 和 132 h 后發(fā)現(xiàn)，隨著暴露濃度的增加和暴露時間的延長，魚血液中膽固醇的含量逐漸升高，但是肝臟中的膽固醇含量則逐漸降低。在 1 mg/L 濃度 132 h 處理組中，膽固醇含量在血液中最高，在肝臟中最低。由此推測，在胡子鯰體內(nèi)，Aldrin 可顯著提高膽固醇從肝臟向血液的轉運效率 (Bano,1982)。在另一項類似的研究中，分別用 2 和 8mg/L的 γ-BHC 有機氯殺蟲劑，以及 1 和 4 mg/L 的 Malathion 有機磷殺蟲劑水體暴露胡子鯰 4 周后發(fā)現(xiàn)，Malathion 可提高雄性胡子鯰肝臟脂質含量，γ-BHC 則降低肝臟中磷脂合成。這 2 種殺蟲劑均可抑制磷脂、脂肪酸和甘油酯從肝臟向性腺的轉運功能，且在不改變膽固醇合成的前提下，均可降低酯化膽固醇向游離膽固醇的轉化效率，以及降低游離脂肪酸向甘油酯的轉變 (Lal and Singh, 1987)。綜合上述研究可知，不管是飼料暴露還是水體暴露，POPs 均能對魚體脂質代謝造成

總脂采用甲醇氯仿法進行測定，使用甲醇：氯仿=1:2 的混合試劑作為脂肪的萃取液。每個處理組選擇 6 條斑馬魚，每兩條魚放置在一個 15ml 玻璃管中稱取魚體重，并放置 7ml 甲醇氯仿萃取液進行勻漿擊打，將擊打后的勻漿液放置 4 度冰箱過夜。次日，每個勻漿樣品中加入 2 ml 0.37 M 的氯化鉀溶液。將組織勻漿液渦旋 3 min 后靜置 2 h，隨后 2000 rpm 離心 10 min。利用巴斯德吸管吸取下層有機相試劑于另一玻璃管中（提前對空玻璃管的重量進行稱重），使用氮吹儀，將取出的下層有機相吹干并稱取玻璃管重量。根據(jù)兩次稱取玻璃管重量的差值，計算出脂肪重量，脂肪與斑馬魚全魚重量的比值即為總脂含量的百分比。斑馬魚麻醉后，每個處理組取 12 條斑馬魚（每個平行樣本 3 條魚）的肝臟、內(nèi)臟和肌肉組織置于凍存管中，使用液氮保存。采用甘油三酯檢測試劑盒（南京建成公司，中國）檢測各組織中甘油三酯的含量，甘油三酯的實驗操作步驟遵從試劑盒說明書。

第二章 內(nèi)分泌干擾物影響魚類脂代謝的生物學機制研究差分析法，兩組之間的顯著性差異分析采用獨立樣品 T 檢驗方法（p<0.05），所有的數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 23 統(tǒng)計軟件（IBM, Armonk, NY, USA）進行分析。1.3 結果與討論1.3.1 不同脂肪水平飼料處理對雌雄斑馬魚脂肪含量的影響本實驗通過檢測斑馬魚的全魚總脂肪含量，以及各組織中的甘油三酯含量分析雌雄魚體的脂肪積累是否存在差異。在同一種脂肪含量飼料投喂下，雌魚總脂
【參考文獻】

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