湖泊富營(yíng)養(yǎng)化和藍(lán)藻水華頻繁爆發(fā)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外迫切關(guān)注的環(huán)境問題,其主要危害之一是微囊藻毒素(Microcystins,MCs)的產(chǎn)生。大量研究表明,MCs不但是典型的肝毒素,還具有明顯的生殖毒性,可對(duì)魚類的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響。為了系統(tǒng)地評(píng)估MCs對(duì)魚類生殖和生長(zhǎng)發(fā)育的毒性效應(yīng),本研究選取模式生物斑馬魚(Danio rerio)作為實(shí)驗(yàn)材料,首先在急性毒性實(shí)驗(yàn)中研究了腹腔注射MC-LR后斑馬魚卵巢的病理損傷及抗氧化系統(tǒng)響應(yīng)的時(shí)間劑量效應(yīng)規(guī)律;進(jìn)一步采用生命周期暴露,從生長(zhǎng)參數(shù)、超微組織病理學(xué)損傷、性激素含量及調(diào)控通路上關(guān)鍵基因表達(dá)水平幾方面,系統(tǒng)分析了環(huán)境相關(guān)劑量下MC-LR對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)、生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的干擾效應(yīng);最后,通過亞慢性暴露實(shí)驗(yàn),從精巢組織學(xué)、性激素含量、相關(guān)基因和蛋白表達(dá)多個(gè)層面,全面地評(píng)估了MC-LR對(duì)成年雄性斑馬魚生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的毒性影響和干擾作用,并對(duì)其雌激素效應(yīng)潛力及產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了合理的推斷。本研究的開展為全面系統(tǒng)地認(rèn)識(shí)MC-LR的生長(zhǎng)和生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)及評(píng)估自然條件下MC-LR雌激素效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要結(jié)果如下:1.在急性毒性實(shí)驗(yàn)中,以雌性斑馬魚為研究對(duì)象,腹腔注射50和200μg/kg BW劑量的MC-LR,分別在注射后1、3、12、24、48、168 h后取樣,研究結(jié)果顯示:卵巢病理變化在注射后12 h內(nèi)呈時(shí)間依賴性增長(zhǎng),主要表現(xiàn)為空泡化、細(xì)胞間隙擴(kuò)大和細(xì)胞溶解;同時(shí)MDA含量顯著升高,伴隨著抗氧化酶CAT、SOD、GPx活性及基因表達(dá)不同程度的增加,表明氧化脅迫在MC-LR引起的生殖毒性中起著重要作用;卵巢中GSH的大量消耗暗示GSH解毒途徑可能在MC-LR解毒中發(fā)揮著關(guān)鍵作用;168 h后卵巢病理損傷和抗氧化機(jī)能的恢復(fù),表明組織中抗氧化防御系統(tǒng)的響應(yīng)是緩解MC-LR毒性影響的重要機(jī)制之一。2.在生命周期實(shí)驗(yàn)中,斑馬魚從幼魚階段(5 d)開始暴露于0、0.3、3和30μg/L MC-LR 90 d至性成熟。結(jié)果表明:環(huán)境劑量(大于3μg/L)的MC-LR可導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻,腦、肝臟病理學(xué)損傷,性腺發(fā)育遲緩;MC-LR對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的抑制效應(yīng)可能是通過下調(diào)GH/IGF軸上游ghrh、pacap1、gh,以及性腺中g(shù)hra、igf3、igf2r(雌魚和雄魚)和igf1(僅雄魚)基因表達(dá)造成的,并表現(xiàn)出一定的雌雄差異性;3和30μg/L濃度下,卵巢T含量顯著下降,而E2含量仍保持穩(wěn)定,結(jié)合HPGL軸基因表達(dá)結(jié)果推測(cè),性激素變化可能由于卵巢發(fā)育遲緩引發(fā)機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié),導(dǎo)致腦中上游基因fshβ和lhβ上調(diào)發(fā)揮補(bǔ)償效應(yīng),促進(jìn)下游性腺中T向E2的轉(zhuǎn)化增加。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,各處理組雌魚肝臟vtg1基因表達(dá)和卵巢中VTG含量均顯著降低,表明MC-LR會(huì)減少雌性斑馬魚卵巢的卵黃儲(chǔ)積,進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的成熟及生殖功能。3.在亞慢性實(shí)驗(yàn)中,將成年雄性斑馬魚暴露于0、0.3、1、3、10、30μg/L MC-LR30 d。研究發(fā)現(xiàn):MC-LR暴露可引起斑馬魚GSI減小、精巢細(xì)胞間隙擴(kuò)大、成熟精子比例降低;MC-LR還能干擾HPGL軸相關(guān)基因表達(dá),造成腦中上游基因(gnrh2、gnrh3、cyp19b、erα、erβ、ar、fshβ和lhβ)普遍出現(xiàn)劑量依賴性下調(diào);精巢中類固醇激素合成基因(star、cyp11a、cyp17、cyp19a和fshr)在3μg/L出現(xiàn)上調(diào),但隨著濃度的繼續(xù)升高而有所回落;精巢中性激素E2和T同樣出現(xiàn)非劑量依賴性升高,在10μg/L濃度下達(dá)到高峰,該結(jié)果暗示MC-LR內(nèi)分泌干擾效應(yīng)可能是其雌激素效應(yīng)和細(xì)胞毒性雙重特性的體現(xiàn)。此外,3、10和30μg/L MC-LR引起雄性斑馬魚肝臟vtg1基因表達(dá)上調(diào),表明長(zhǎng)期持續(xù)性的MC-LR暴露可能對(duì)雄性斑馬魚產(chǎn)生雌激素效應(yīng);HPGL軸基因表達(dá)和精巢性激素含量的相關(guān)性分析表明,精巢中E2和T的含量變化與腦和肝臟中基因表達(dá)及肝臟ER蛋白表達(dá)變化相關(guān)性較低,但與精巢類固醇激素合成相關(guān)基因表達(dá)顯著相關(guān),推測(cè)MC-LR的雌激素效應(yīng)可能是通過干擾類固醇激素的合成,而非ER途徑介導(dǎo)的。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X503.225;S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 MC-LR 的分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 Structure of MC-LR然環(huán)境中 MC-LR 為中性或者帶負(fù)電荷，由于極性的作用，它酮等溶劑，其在水中的溶解度大于 1 g/L（Rivasseau et al 1998）

圖 1-2 性類固醇激素合成通路及關(guān)鍵基因Fig. 1-2 Synthetic pathway of sex steroid hormones and related key genes如圖 1-2 所示，最初，膽固醇在類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）的作用

圖 2-1 RNA 提取的部分電泳圖Fig.2-1 An electrophoresis figure of RNA extraction RNA，用 PrimeScript RT Reagents 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（
【參考文獻(xiàn)】

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