作為持久性有機(jī)污染物(Persistent organic pollutants,POPs)的典型代表,多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)和多氯聯(lián)苯(polychlorinatedbiphenyls,PCBs)的分析方法、環(huán)境影響及其污染修復(fù)技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)研究領(lǐng)域,生物降解特別是微生物降解被認(rèn)為是去除環(huán)境中PAils、PCBs的主要途徑。本文在全面綜述國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,通過調(diào)查和監(jiān)測(cè)選擇并確定了PAHs、PCBs污染的土壤樣品,篩選得到的一株可以高效降解PAHs、PCBs的菌株,基于形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)、細(xì)胞化學(xué)成分鑒定及16S rDNA序列比對(duì)分析等手段,鑒定該菌株屬于兩面神菌屬(Janibacter sp.),命名為JY11。以此為基礎(chǔ),系統(tǒng)研究了JY11對(duì)PAHs、PCBs的降解效果和影響因素以及與Phanerochaete.chrysosporium JY16聯(lián)合降解效率,并借助氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)降解中間產(chǎn)物的定性分析,初步探討了該菌株對(duì)菲、芘、苯并(α)芘和PCB18、PCB77的代謝途徑。論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下: 1.污染土壤中PAHs和變壓器油中PCBs的提取及分析 (1)采用索氏提取、超聲提取及超臨界CO_2提取三種樣品前處理技術(shù),結(jié)合GC-FID分析技術(shù),研究獲得了濟(jì)南煉油廠及勝利油田土壤中PAHs的污染特征。濟(jì)南煉油廠土壤中檢出全部16種PAHs,濃度范圍為5.0～593.2μg/kg;勝利油田采油廠土壤中檢出12種PAHs,濃度范圍為227.7～1107.3μg/kg,兩處土壤均在一定程度上受到了PAHs的污染。三種提取技術(shù)均有很好的提取效率和重現(xiàn)性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)小于5%(n=3),PAHs加標(biāo)回收率為88.7%～102.6%,符合美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)中環(huán)境樣品回收率(70%-140%)及RSD%(＜20%)的要求。 (2)采用液液萃取、超聲萃取及固相萃取等三種樣品前處理技術(shù),結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的PCBs分析方法,研究建立了簡(jiǎn)便快速的PCBs提取及GC-ECD分析技術(shù)。研究測(cè)定了廢棄國(guó)產(chǎn)變壓器油中類二噁英類及阻轉(zhuǎn)類PCBs的成分與含量,檢出10種類二噁英類PCBs(PCB77,8l,105,114,118,123,126,156,167,189)和4種阻轉(zhuǎn)類PCBs(PCB45,95,132,149)。實(shí)驗(yàn)還結(jié)合Areolor 1242標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)變壓器油中PCBs組分進(jìn)行了分析,得到PCBs的分布特征:二氯聯(lián)苯含量為14.2%;三氯聯(lián)苯含量為51.2%;四氯聯(lián)苯含量為29.8%;五氯和六氯聯(lián)苯含量為4.8%。由此可見,國(guó)產(chǎn)變壓器油以三氯聯(lián)苯為主,高氯代PCBs所占比例很少。三種提取方法的RSD%均小于5%(n=3),內(nèi)標(biāo)PCB209的回收率為82.3%～91.6%,符合美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)中回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。 2.PAHs、PCBs降解菌的分離與鑒定 (1) PAHs、PCBs優(yōu)勢(shì)降解菌的分離。采集濟(jì)南市煉油廠、勝利油田采油廠及原濟(jì)南市變壓器廠的土樣,以菲、蒽、芘的混合樣品為唯一碳源,采用定時(shí)定量轉(zhuǎn)接、逐步提高碳源濃度的方法,共獲得125個(gè)單菌落,經(jīng)降解效率初步測(cè)定,選取降解能力較強(qiáng)的兩株細(xì)菌JY11和JY3A進(jìn)行鑒定研究。 (2) JY11和JY3A的鑒定。通過形態(tài)特征描述,綜合運(yùn)用生理生化檢測(cè)、脂肪酸分析、甲基萘醌分型及GC摩爾百分含量測(cè)定等方法,結(jié)合16S rDNA序列分析、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,JY3A被認(rèn)為屬于Bacillus菌屬的B.subtilis類群,由于Bacillus菌屬目前定名的復(fù)雜性和不確定性,尚需進(jìn)一步PFGE和DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持鑒定到種。 (3) JY11被鑒定為Janibacter菌屬。該屬1997年方予以命名,確定模式種為Janibacter limosus,至今僅有5個(gè)種的報(bào)道。但JY11與該屬模式種有較大差異,與其遺傳距離最近的為Janibacter anophelis。細(xì)胞脂肪酸組成及含量分析結(jié)果表明,JY11在脂肪酸化學(xué)分類特征上表現(xiàn)出獨(dú)特的菌株特異性,不同于Janibacter limosus和Janibacter anophelis的已有報(bào)道。初步實(shí)驗(yàn)表明JY11在表現(xiàn)出良好的PAHs降解能力的同時(shí),對(duì)PCBs亦有較好的降解能力,因此選擇JY11菌作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。 3.Janibacter sp.JY11對(duì)PAHs、PCBs的降解效果及影響因素研究 (1) Janibacter sp.JY11對(duì)PAHs的降解效果 研究了液體培養(yǎng)條件下,Janibacter sp.JY11對(duì)初始濃度為100 mgl PAHs的降解效果。結(jié)果表明,Janibacter sp.JY11不僅對(duì)低分子量PAHs如菲、芴、苊等有很好的降解效果,對(duì)四環(huán)的芘、熒蒽、苯并(α)蒽等也有較好的降解效果,五環(huán)和六環(huán)的高分子量PAHs也有不同程度的降解。由此可見,JY11表現(xiàn)出非常寬的降解底物譜及很強(qiáng)的降解能力。 (2)影響Janibacter sp.JY11對(duì)PAHs的降解效率的因素 實(shí)驗(yàn)中分別以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并(α)芘為代表,研究了不同PAHs初始濃度、不同濃度的表面活性劑Tween 80和Triton X-100及水楊酸誘導(dǎo)作用對(duì)PAHs降解效率的影響。結(jié)果表明:隨著初始濃度的增加,芘和苯并(α)芘的降解效率逐漸降低,而菲則可以在很寬的濃度范圍內(nèi)全部降解;表面活性劑Tween 80對(duì)PAHs降解有一定的促進(jìn)作用;通過用水楊酸做共代謝底物,相比用菲作共代謝底物,苯并(α)芘的降解效率提高了28%。 (3) Janibacter sp.JY11對(duì)PCBs的降解效果 實(shí)驗(yàn)研究了在液相純培養(yǎng)條件下,JY11對(duì)初始濃度分別10 mg/l及100 mg/lPCBs的降解效果。結(jié)果表明,隨著初始濃度增加,降解效率略有下降,但總體上JY11對(duì)PCBs具有較好的降解效果。對(duì)于初始濃度為10 mg/l的PCBs,二氯及三氯PCBs的降解效率為83%～100%,多數(shù)高于90%;四氯PCBs的降解效率為78%～94%;五氯及六氯PCBs的降解效率也達(dá)到50～455%。JY11對(duì)鄰位、對(duì)位取代PCBs均可降解,只是隨著氯原子數(shù)增加,降解效率降低。由此可見,氯原子取代位置并不是影響JY11對(duì)PCBs降解的主要因素。 (4)天然植物組分誘導(dǎo)Janibacter sp.JY11降解PCBs 通過在液體培養(yǎng)基中添加九州蟲草子座揮發(fā)油、唐古特青蘭揮發(fā)油、草果揮發(fā)油、香芹酮、檸檬烯等天然植物組分,考察了其對(duì)Jannibactor sp.JY11降解PCBs效率的影響。結(jié)果表明九州蟲草子座揮發(fā)油、香芹酮能顯著提高絕大多數(shù)PCBs的降解效率,檸檬稀也有一定的促進(jìn)作用。 4.Janibacter sp.JY11-P.chrysosporium JY16聯(lián)合降解PAHs、PCBs 利用白腐真菌胞外氧化還原酶系豐富,底物專一性低,對(duì)外源物質(zhì)的降解不受其濃度大小的影響等優(yōu)點(diǎn),在Janibacter sp.JY11中加入一株白腐真菌—黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium JY16),研究其聯(lián)合降解作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:液體培養(yǎng)條件下,混合菌對(duì)PAHs的降解效果明顯好于單一菌降解效果,尤其是四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并(α)蒽、苯并(κ)熒蒽的降解效率相比JY11單獨(dú)降解提高了20%以上。對(duì)于模擬污染土壤環(huán)境,混合菌對(duì)芘和苯并(α)芘的降解效率分別為73%和60%,相比用單一菌降解也得到很大程度的提高。同樣液體培養(yǎng)條件下,混合菌對(duì)PCBs的降解效果明顯優(yōu)于單一菌降解效果。尤其是對(duì)于類二噁英類的六氯聯(lián)苯PCB156,167和七氯聯(lián)苯PCB189,單一菌并不利用;而當(dāng)兩株菌聯(lián)合降解時(shí),三種高氯PCBs降解了10%左右。在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,用混合菌直接降解變壓器油及模擬污染土壤中的PCBs。結(jié)果表明:變壓器油中PCBs的降解效率為8.7%～83.3%;對(duì)于模擬污染土壤樣品,除PCB74,類二噁英類PCB105,118和阻轉(zhuǎn)類PCB132,149沒有降解外,其余PCBs的降解效率為18.4%～72.6%。 5.Janibacter sp.JY11降解PAHs、PCBs中間產(chǎn)物及代謝途徑初步分析 以三環(huán)的菲、四環(huán)的芘和五環(huán)的苯并(α)芘作為JY11降解PAHs代謝途徑分析的研究對(duì)象;以三氯PCB18及類二噁英類PCB77作為JY11降解PCBs代謝途徑分析的研究對(duì)象,利用GC-MS技術(shù),通過對(duì)中間產(chǎn)物的檢測(cè),初步推導(dǎo)了JY11降解PAHs、PCBs的代謝途徑。 (1)菲:菲在雙加氧酶的作用下生成順式-2,3-二氫-二羥基菲,然后轉(zhuǎn)化成1-羥基-二萘酸,脫羧后生成1-萘酚,最后開環(huán)生成水楊酸。 (2)芘:芘在雙加氧酶的作用下生成順式-4,5-二氫-二羥基芘,然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式-4,5-二羥基芘,該產(chǎn)物進(jìn)一步通過雙加氧酶開環(huán)生成4,5-二羧酸菲,最終在脫羧酶的作用下生成4-羥基菲,最后開環(huán)生成鄰苯二甲酸。 (3)苯并(α)芘:苯并(α)芘在雙加氧酶的作用下生成順式-7,8-二氫-二羥基苯并(α)芘,然后在脫氫酶作用下重新芳香化生成順式7,8-二羥基苯并(α)芘,該產(chǎn)物進(jìn)一步通過雙加氧酶開環(huán)生成7-羥基-8-羧酸芘。 (4)三氯聯(lián)苯PCB18和四氯聯(lián)苯PCB77代謝途徑基本相同,即JY11進(jìn)攻PCBs的2,3位,生成2,3.二氫二羥基-PCBs,該產(chǎn)物在脫氫酶的作用下生成2,3-二羥基-PCBs;然后在第二個(gè)雙加氧酶作用下開環(huán)生成2,5-二氯-2-羥基-6-氧-6-2,5-二氯苯基-2,4-己二烯酸,該產(chǎn)物在水解酶的作用下生成氯代苯甲酸。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：X172
【部分圖文】：

清楚的代謝途徑只有蔡、菲等低分子量PAHs，而自然界中高分子量PAHs由于具有多種微生物代謝途徑[45]，至今仍是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[46，4刀。圖1一2即為報(bào)道的低分子量PAHs微生物好氧降解的一般途徑[48】。在PAHs誘導(dǎo)下，微生物會(huì)分泌單加氧酶或雙加氧酶[49]，在這些酶的催化作用下，把氧加到苯環(huán)上，形成C一O鍵，再經(jīng)過加氫、脫水等作用使碳碳鍵斷裂，苯環(huán)數(shù)減少。在此過程中，細(xì)菌對(duì)PAHs降解的第一步是將兩個(gè)氧原子直接加到芳香核上，催化這一反應(yīng)的酶被稱作PAHs雙加氧酶，這是一個(gè)由還原酶、鐵氧還原蛋白、鐵硫蛋白組成的酶復(fù)合物150]

導(dǎo)落 5010.015.020刀25.035.040， 0min圖2一 2Areolor1242標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(GC一ECD)Fig.2一 2ChromatograjrnofAreolor1242standard(GC一ECD)圖2一2是戶 Jcolor1242(romgN正己烷)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，主要色譜峰的歸屬參考文獻(xiàn)113’，’32]并結(jié)合Gc一Ms技術(shù)。每個(gè)色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.1%(n=3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)合戶 Jcofor1242標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)變壓器油中PCBs的組成及含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2一7，該結(jié)果為分析超聲提取物所得。

山東人學(xué)博十學(xué)位論文C圖3一 1JYll菌照片:A.含有菲的BSM平板JYll菌落形態(tài);B.JYll透射電鏡照片(IOxk);C.JYll透射電鏡照片(16xk);D.JYll革蘭氏染色照片(IOxl00) F19.3一 1PhotograPhsofeellofJYllstrain:A.ClonesofJYllstrainonBSMPlateswith Phenanthrene;B.TEMPhotoofJYll(10xk);C.TEMPhotoofJYI](16xk):D.Gramstain photoofJYIlstrain(10xlOO)表3一ZJYll菌落形態(tài)及生理生化特性Table3一 2MorphologiealandbioehemiealcharacteristiesofJYll特性 strainJYll菌落顏色(Colo:ofeolonies)菌落形態(tài)(Morpholo群)運(yùn)動(dòng)性(Motility)革蘭氏染色 (Gramstraining)抱子產(chǎn)生 (Sporeformation)氧化酶 (Oxidasereaetion)過氧化氫酶(eatalase:eaetion)硝酸鹽還原(Nitrate:eduetion)11引噪試驗(yàn) (Indoleproduetiontest)甲基紅試驗(yàn) (Methylredtest，MR)乙酞甲基甲醉試驗(yàn) (vogesProskaue:test，v.P)石蕊牛奶(Litmus一 milktest)白色或灰白色短桿，球形(W)+十藍(lán)色、產(chǎn)堿
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