工業(yè)發(fā)展的大爆發(fā),往往伴隨著環(huán)境嚴(yán)重污染的沉重代價(jià)。隨著世界工業(yè)尤其是采礦業(yè)、冶煉業(yè)、印染業(yè)、電鍍業(yè)等的迅速發(fā)展以及農(nóng)藥、化肥的大量使用,嚴(yán)重地污染了土壤、水質(zhì)和空氣,其中土壤中的重金屬(Hg、Cd、As、Cu和Al)污染尤為嚴(yán)重。汞是一種極毒的重金屬元素,其毒性位于各金屬之首。汞是植物的非必需元素,對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育毒性顯著,當(dāng)植物體中的汞積累到一定程度后,會(huì)通過(guò)不同的途徑干擾和破壞細(xì)胞正常的代謝過(guò)程,導(dǎo)致植物生長(zhǎng)異常直至死亡；同時(shí)汞通過(guò)植物進(jìn)入食物鏈富集后會(huì)危害動(dòng)物及人體健康。植物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,形成了一系列潛在的機(jī)制,間接或直接的參與重金屬毒害的解除或適應(yīng)于重金屬脅迫的環(huán)境,涉及形態(tài)、生理、發(fā)育、分子細(xì)胞等各個(gè)層次的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。鹽生植物海馬齒(Sesuvium portulacastrun)屬番杏科(Aizoaceae)海馬齒屬(Sesuvium),草本或亞灌木植物,分布于熱帶和亞熱帶海岸的沙灘上。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)海馬齒不僅能適應(yīng)高濃度的鹽環(huán)境而且能吸附積累大量的Hg2+。在本研究中,從蛋白質(zhì)組學(xué)、基因差異,結(jié)合相應(yīng)的植物形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理變化對(duì)海馬齒耐汞性機(jī)理進(jìn)行了初步的研究；同時(shí)通過(guò)分子生物學(xué)方法從海馬齒植物中分離了三個(gè)與耐汞相關(guān)的新基因,并對(duì)它們?cè)谖⑸锖蛿M南芥植物中進(jìn)行了功能分析,結(jié)果如下： 1、利用雙向電泳技術(shù),獲得無(wú)Hg2+脅迫下和Hg2+下的海馬齒總蛋白點(diǎn)1019個(gè),上調(diào)或下調(diào)2倍以上的蛋白點(diǎn)有116個(gè),汞脅迫下新出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)99個(gè)。 2、本研究挑選上調(diào)或下調(diào)2倍以上,或新的蛋白點(diǎn)46個(gè),其中上調(diào)3倍以上為35個(gè),下調(diào)2倍以上為5個(gè),在Hg2+脅迫下新出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)6個(gè)進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜分析。通過(guò)質(zhì)譜分析,其中19個(gè)蛋白點(diǎn)被鑒定出來(lái),這些蛋白點(diǎn)按功能分類,可分為6類：(Ⅰ)光合作用相關(guān)蛋白,占42%；(Ⅱ)能量代謝蛋白,占26%；(Ⅲ)氨基酸代謝蛋白,占11%；(Ⅳ)核苷酸代謝蛋白,占11%；(Ⅴ)響應(yīng)逆境脅迫和防御相關(guān)蛋白,占5%；(Ⅵ)未知功能和假想蛋白,占5%。 3、結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果,利用分子生物學(xué)手段,對(duì)海馬齒中4個(gè)基因進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA序列克隆,得到了其中3個(gè)基因的全長(zhǎng)序列并登陸,它們分別為金屬硫蛋白基因(SpMT),GenBank登錄號(hào)：JN185440；谷氨酰胺合成酶基因(SpGS)GenBank登錄號(hào)：JQ425085；葉綠體ATP酶α亞基基因(SpF-ATP-α)GenBank登錄號(hào)：JN192444;及一個(gè)基因的部分序列,葉綠體ATP合酶β亞基基因(F-ATP-β),并對(duì)三個(gè)全長(zhǎng)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。 4、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),分析了三個(gè)全長(zhǎng)基因組織特異性表達(dá)情況及對(duì)汞離子脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明：三個(gè)基因均主要在葉片中表達(dá),葉中的表達(dá)量明顯高于根與莖中的表達(dá)量。在含汞的環(huán)境下,SpMT與SpF-ATP-α基因明顯響應(yīng)Hg2+脅迫,其表達(dá)量隨Hg2+的增高和脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)而增高。SpGS基因在低濃度汞處理時(shí)其表達(dá)量升高,高濃度Hg2+脅迫下SpGS基因表達(dá)被抑制,但是隨著脅迫時(shí)間的增長(zhǎng),無(wú)論是在高濃度還是低濃度汞脅迫下SpGS基因表達(dá)量均有上升的趨勢(shì)。 5、構(gòu)建了SpMT、SpGS、SpF-ATP-α三個(gè)基因的原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。根據(jù)金屬硫蛋白的特殊性質(zhì),構(gòu)建了三個(gè)含有不同分子伴侶的SpMT基因原核表達(dá)載體,分析了不同的分子伴侶對(duì)金屬硫蛋白基因在原核中表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)帶SUMO分子伴侶的P-Cold-sumo載體最適合表達(dá)金屬硫蛋白。構(gòu)建了帶SUMO分子伴侶的SpGS、SpF-ATP-α P-Cold-sumo載體,并分析了它們?cè)谖⑸镏械谋磉_(dá)情況,結(jié)果表明SpGS、SpF-ATP-α基因均能成功表達(dá)。 6、SpMT、SpGS、SpF-ATP-α在大腸桿菌Ecoli Top10中表達(dá),SpMT能明顯提高E.coliTop10的耐汞能力,而轉(zhuǎn)SpGS基因的EcoliTop10具有輕微的耐汞性,SpF-ATP-α則不能提高大腸桿菌Ecoli Top10的耐汞能力。 7、構(gòu)建了SpMT基因植物表達(dá)載體pVKH-35s-SpMT并成功轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥,耐汞性分析表明：SpMT基因能明顯提高擬南芥對(duì)汞的耐受性,植物表現(xiàn)為：在含有濃度為5μ mol/L及10μmol/L HgCl2的培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng),生物量、葉綠素含量、根的數(shù)目及長(zhǎng)度明顯高于對(duì)照。 8、與GFP基因融合,構(gòu)建了pCAMBIA-1304-35s-SpMT植物表達(dá)載體,并將其在洋蔥表皮細(xì)胞中表達(dá)。亞細(xì)胞定位表明：SpMT基因主要為核表達(dá),膜上有微量的表達(dá)。 9、測(cè)定了不同濃度和不同時(shí)間汞脅迫下,海馬齒谷氨酰胺合成酶與葉綠體ATP合酶活性變化的情況,結(jié)果表明,ATP合酶活性在汞脅迫環(huán)境下隨著時(shí)間的增長(zhǎng)和濃度的增高而增高,海馬齒谷氨酰胺合成酶活性在低濃度汞脅迫環(huán)境下隨著時(shí)間的增長(zhǎng)和濃度的增高而增高,高濃度汞脅迫環(huán)境下,其活性出現(xiàn)先被抑制,一段時(shí)間后再升高的趨勢(shì)。 10、通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),Hg2+對(duì)海馬齒葉片的傷害主要表現(xiàn)為：1)細(xì)胞膜不斷向胞內(nèi)形成膜突起再形成空泡；2)隨著Hg2+濃度不斷升高,其葉綠體數(shù)目不斷減少,體積變大,形狀由橢圓型變成長(zhǎng)型；3)類囊體基粒片層變得模糊不清；4)線粒體數(shù)目由少變多,形狀由棒狀變成圓形及橢圓型,線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)與嵴變得模糊不清；5)細(xì)胞核核仁由一個(gè)變成多個(gè),最后消失。 11、通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：1)在Hg2+脅迫下,海馬齒根的表面結(jié)構(gòu)變得散亂,而無(wú)Hg2+的海馬齒根的表面結(jié)構(gòu)緊湊有序;2)Hg2+迫下葉片表面的氣孔數(shù)目較多,大多數(shù)呈閉合狀態(tài),保衛(wèi)細(xì)胞大而飽滿成半圓形,冷凍干燥后葉片表面無(wú)皺褶；而非汞脅迫下,葉片表面的氣孔數(shù)目較少,保持開(kāi)放狀態(tài),保衛(wèi)細(xì)胞為長(zhǎng)條形,冷凍干燥后葉片皺褶的厲害；3)在非Hg2+下海馬齒莖橫切面的導(dǎo)管成規(guī)則狀排列,導(dǎo)管壁較薄,而在Hg2+脅迫下導(dǎo)管變大、成不規(guī)則狀排列,導(dǎo)管壁厚,壁上多了很多內(nèi)含物。
【學(xué)位單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2012
【中圖分類】：X173
【部分圖文】：

(引用 BarkayT 等 2003)圖1自然環(huán)境中的錄循環(huán)Fig. 1 The mercury cycle in natural environment

世界上最主要的汞排放屬商年的汞排觸且(陶年)

匕.操獲升隨洲田

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本文編號(hào)：2812530