鎘是許多工業(yè)廣泛使用的高毒重金屬環(huán)境污染物,鎘對人和其他哺乳動物的肝、腎、肺、胰腺、睪丸、胎盤和骨等許多器官和組織都有毒性。鎘所致機體損傷的機制十分復雜且尚不明確,體內(nèi)外實驗研究證明鎘可引起細胞氧化應激或凋亡/死亡,且凋亡與線粒體、細胞內(nèi)鈣離子動態(tài)平衡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活等有關。對嚙齒動物研究證明,鎘最初主要累積在肝臟,所以暴露毒性劑量的鎘首先引起肝臟受損。本論文以大鼠肝細胞為模型,采用細胞生物學和分子生物學的方法研究鎘致體外培養(yǎng)大鼠肝細胞的毒性作用及機理。 1.鎘對大鼠肝細胞毒性損傷的研究 采用兩步灌流法獲得大鼠肝細胞,經(jīng)過24h培養(yǎng),換以含2.5、5、10μmol/L醋酸鎘的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h和24h,測定鎘對細胞存活率、細胞培養(yǎng)上清液中LDH、ALT和AST的活性,以及鎘對細胞形態(tài)、超微結構的影響。 結果表明,隨著鎘濃度的增大,肝細胞的存活率逐漸降低,12h和24h時各劑量染鎘組細胞存活率均極顯著低于對照組(P0.01)；隨著鎘劑量的增加和作用時間的延長,細胞急劇變形,壞死細胞增多,線粒體腫脹變形,線粒體嵴模糊,內(nèi)容物皺縮空泡化或最終崩解。LDH、AST和ALT釋放量隨劑量增加而增加,部分劑量組LDH、AST和ALT活性與對照組相比差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)。 2.鎘對大鼠肝細胞凋亡及氧化損傷的研究 醋酸鎘處理肝細胞,測定鎘對細胞凋亡率、氧化應激指標、活性氧(ROS)水平及線粒體膜電位(△Ψm)的變化。 結果表明,12h時細胞內(nèi)GSH含量隨鎘劑量增高而降低,部分劑量組極顯著(P0.01)低于對照組,24h時隨劑量增高而升高,5和10μmol/L劑量組顯著或極顯著(P0.01)高于對照組,GSH-PX的活性變化與之相反；隨著鎘劑量的增大和作用時間延長,SOD和CAT活性、MDA含量均升高,部分劑量與對照組相比差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)；而GST和GR活性降低,但與對照組無明顯差異(P0.05)；細胞凋亡率升高,細胞內(nèi)ROS水平增加和△Ψm降低,部分劑量組與對照組差異顯著或極顯著(P0.05或P0.01)；表明鎘可致肝細胞產(chǎn)生氧化應激,且通過線粒體途徑引起細胞凋亡。 3.N-乙酰半胱氨酸對鎘致肝細胞損傷的影響 對肝細胞染毒的同時添加NAC,通過測定肝細胞的存活率、細胞形態(tài)和凋亡、△甲m和ROS的變化,觀察NAC對鎘致大鼠肝細胞損傷的保護作用。 結果表明,NAC可顯著或極顯著提高鎘處理細胞存活率(P0.05或P0.01),呈劑量-效應關系,NAC可使鎘處理組皺縮和壞死細胞、凋亡細胞明顯減少,顯著或極顯著降低鎘處理細胞ROS生成和阻止△Ψm的降低(P0.05或P0.01)。表明NAC可有效保護鎘致大鼠肝細胞的毒性損傷。 4.鎘致大鼠肝細胞凋亡的非caspase途徑 用醋酸鎘處理肝細胞,觀察caspase-3含量變化以及caspases廣譜抑制劑Z-VAD-fink對鎘致細胞存活率、形態(tài)和凋亡變化的影響。 結果表明,鎘暴露的不同時間,肝細胞caspase-3活性無明顯變化,與對照組差異不顯著(P0.05); Z-VAD-fmk對鎘所致的細胞存活率、細胞形態(tài)和細胞凋亡無顯著影響。表明caspase途徑未參與鎘致大鼠肝細胞的凋亡過程。 5.鈣離子超載在鎘致大鼠肝細胞凋亡中的作用 通過不同濃度醋酸鎘處理肝細胞,不同時間點測定細胞內(nèi)鈣離子濃度,以及鈣離子抑制劑Bapta-AM對鎘致細胞內(nèi)鈣離子濃度、細胞存活率、細胞形態(tài)、細胞凋亡、細胞內(nèi)ROS和△Ψm變化的影響。 結果表明,鎘暴露1.5h時細胞內(nèi)鈣離子水平極顯著升高(P0.01),但隨著時間的延長,細胞內(nèi)鈣離子水平迅速下降,并接近對照組水平。而Bapta-AM可以顯著降低鎘引起的鈣離子水平升高,并顯著提高鎘處理細胞的存活率(P0.05)。另外Bapta-AM可使鎘處理細胞形態(tài)趨于完整、并使變形細胞和凋亡細胞減少,顯著或極顯著減少ROS產(chǎn)生和抑制△Ψm降低(P0.05或P0.01)。說明鎘可致肝細胞內(nèi)鈣離子水平升高,鈣離子抑制劑Bapta-AM能有效降低細胞內(nèi)鈣離子水平及細胞損傷,提示鈣離子超載在鎘致肝細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。 6.鎘致大鼠肝細胞凋亡的MAPK途徑 在10μmol/L醋酸鎘處理肝細胞的同時,用p38抑制劑SB202190、JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑U0126單獨或聯(lián)合作用于肝細胞,測定細胞存活率、細胞形態(tài)、細胞凋亡率、△甲m和磷酸化p38蛋白表達的變化。 結果表明,SB202190可以顯著或極顯著提高鎘處理組細胞的存活率,減少變形細胞和凋亡細胞數(shù)量(P0.05或P0.01),但SP600125和U0126作用相反。鎘可極顯著提高肝細胞磷酸化p38的表達量(P0.01),而SB202190能極顯著降低其表達(P0.01)；SB202190還可極顯著升高鎘引起的△甲m降低(P0.01)。說明鎘暴露使肝細胞產(chǎn)生的ROS引起p38 MAPK途徑激活,并通過損傷線粒體引起細胞凋亡。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：X174
【部分圖文】：

剛分離的大鼠肝細胞Fig.l-1Freshisolatedrat圖1-2臺盼蘭染色的肝細胞圖1一培養(yǎng)24h的大鼠肝細胞Fig.l

HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2錫對細胞內(nèi)SOD和CAT活性、MDA含量的影響如表2一2和圖2一5硯一7所示。12h時，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的濃度為5娜。譏和10腳。譏時，soD的活性與對照組相比差異極顯著(p<0.01);福的濃度為10林mo比時，CAT的活性和MDA的含量與對照組相比差異極顯著或顯著(尸<0.01或尸<0.05)。24h時，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性均升高，鍋的濃度為10林mol幾時，SOD活性和MDA含量與對照組相比差異分別極顯著或顯著(P<0.01或尸<0.05);鍋的濃度高于5娜。譏時

02.55以(卿。比)圖2一4福對肝細胞GR活性的影響o一10卿ol/L錫作用肝細胞12h或24hFig.2一 4EffectofCdontheGRactivityinhePatoeytes HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2錫對細胞內(nèi)SOD和CAT活性、MDA含量的影響如表2一2和圖2一5硯一7所示。12h時，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的濃度為5娜。譏和10腳。譏時，soD的活性與對照組相比差異極顯著(p<0.01);福的濃度為10林mo比時，CAT的活性和MDA的含量與對照組相比差異極顯著或顯著(尸<0.01或尸<0.05)。24h時，隨著福濃度的增大，SOD和CAT活性均升高，鍋的濃度為10林mol幾時，SOD活性和MDA含量與對照組相比差異分別極顯著或顯著(P<0.01或尸<0.05);鍋的濃度高于5娜。譏時

【引證文獻】

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本文編號：2812232