【摘要】：百菌清是一種廣譜氯代芳香族殺真菌劑,是美國第二大類農(nóng)業(yè)殺真菌劑,年使用量為5000噸,而我國百菌清年產(chǎn)量超過了8000噸。百菌清對于魚、鳥和水生無脊椎動物具有高毒性,并且在生態(tài)系統(tǒng)中被廣泛檢測到,其造成的污染已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。百菌清污染的生物修復(fù)被認(rèn)為是一種有效、可靠和無二次污染的方法。因此,篩選高效降解百菌清的微生物菌種資源,探索其降解百菌清的作用機(jī)理,充分發(fā)揮其降解能力,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。 本研究的意義在于分離、篩選高效百菌清降解菌株,并對菌株在不同環(huán)境條件下降解百菌清的特性進(jìn)行研究,以期為百菌清污染環(huán)境的修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)；同時克隆百菌清的降解關(guān)鍵酶基因,進(jìn)一步研究降解酶的特性、催化機(jī)制等,闡明氯代芳香族化合物的水解脫氯新機(jī)制。 本文通過富集培養(yǎng)的方法,從百菌清污染的水樣和土壤中分離到15株百菌清降解菌株,分別命名為CTN-1～CTN-15。對這15株百菌清降解菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析、染色體ERIC-PCR指紋圖譜分析,結(jié)果顯示這15株菌具有豐富的多樣性。經(jīng)生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,15株菌株分別被鑒定為Ochrobactrum sp., Pseudoxanthomonas sp., Bordetella sp., Shinella sp., Caulobacter sp., Rhizobium sp., Pseudomonas　sp.和Lysobacter sp等八個不同的屬。根據(jù)細(xì)胞壁脂肪酸成份、極性酯、醌、G+C mol%、DNA-DNA雜交、生理生化、16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析等,將Lysobacter sp. CTN-1鑒定為Lysobacter屬中的一個新種,命名為瑞身溶球菌Lysobacter ruishenii sp. nov. CTN-1T(=DSM 22393T=CGMCC 1.10136T)。 隨機(jī)選取分屬于不同屬的8株百菌清降解菌株,比較了菌株對百菌清的降解能力,結(jié)果顯示8株菌對百菌清的降解能力有很大差異,尤其是降解速率,從4-40 mg·1-1·d-1不等,分離自水樣的5株菌的降解能力明顯優(yōu)于土壤中的3株菌。菌株CTN-3和CTN-14在液體培養(yǎng)基中降解速率最快,12 h幾乎完全轉(zhuǎn)化20 mg·1-1的百菌清。百菌清代謝途徑研究表明15株菌降解百菌清的產(chǎn)物均為羥基百菌清。該研究結(jié)果為百菌清污染環(huán)境的生物修復(fù)提供了豐富的菌種資源。 采用SDS高鹽結(jié)合CTAB法從百菌清降解菌株P(guān)seudomonas sp. CTN-3中提取高質(zhì)量的染色體總DNA,用鳥槍法構(gòu)建了總DNA的基因組文庫。從大約15,000個轉(zhuǎn)化子中篩選到2個具有百菌清脫氯活性的陽性克隆子1-10和2-1。用軟件分析及亞克隆的方法,確定了編碼百菌清脫氯酶(Chd)的1026 bp長結(jié)構(gòu)基因chd,通過chd基因序列的Blast比對,發(fā)現(xiàn)在基因水平上無任何同源序列；在氨基酸水平上,發(fā)現(xiàn)其具有金屬β-內(nèi)酰胺酶超家族的一個假定保守區(qū),并且與一些金屬水解酶最高同源性也只有29%。例如,與來自Streptomyces coelicolor的環(huán)化酶具有29%%的同源性,與來自Stackebrandtia nassauensis依賴于鋅的水解酶具有27%的同源性,與來自Candidatus Koribacter versatilis類-β-內(nèi)酰胺酶具有24%的同源性。可見,克隆到的chd是一個全新的百菌清水解脫氯酶基因。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Chd具有金屬β-內(nèi)酰胺酶的折疊特征,為p-折疊核心區(qū)被α-螺旋包圍的αβ/βα三明治折疊。而且,在Chd中也發(fā)現(xiàn)金屬p-內(nèi)酰胺酶最典型的特征標(biāo)簽His-X-His-X-Asp-His,有意思的是,第一個氨基酸是Ser而不是His。顯示該酶是報道的第一個來源于金屬β-內(nèi)酰胺酶超家族的水解脫氯酶。根據(jù)確定的ORF,設(shè)計特異性引物,成功的從十五株降解菌株的基因組序列中擴(kuò)增到百菌清水解脫氯酶結(jié)構(gòu)基因,研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)基因大小從1002到1026 bp不等,十五株百菌清農(nóng)藥降解菌中的百菌清水解脫氯酶編碼基因共有48處堿基位點有變化,其各亞型之間的同源性為99%左右。 將百菌清脫氯酶結(jié)構(gòu)基因連接到表達(dá)載體pET29a上,在E.coli BL21中實現(xiàn)了高效表達(dá)。通過MS/MS、NMR等多種方法進(jìn)一步鑒定Chd轉(zhuǎn)化百菌清的產(chǎn)物為4-羥基百菌清,并且證明Chd能在厭氧條件下進(jìn)行百菌清的脫氯,表明Chd是一個水解脫氯酶而不是氧化酶,從而將Chd定義為一個新的氯代芳香族化合物的水解脫氯酶(EC3.8.1.12)。 對百菌清水解脫氯酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。建立了Chd的酶學(xué)反應(yīng)體系：50 mMPBS (pH7.0),0.2mM百菌清,反應(yīng)酶量50μl,50℃反應(yīng)10 min,用3 ml二氯甲烷中止反應(yīng),立即測定OD232值。酶活力單位(U)定義為：在pH 7.0,溫度50℃條件下,每分鐘催化減少1μmol百菌清所需的酶量。Chd酶學(xué)特性研究顯示,30℃到70℃,溫度對酶活力的影響不大,其最適反應(yīng)溫度為50℃,從30℃開始至40℃相對活力僅下降12%,50℃時處理10 min,相對酶活下降不足5%,而處理1h后,相對酶活下降至18%,50℃到70℃的范圍內(nèi),相對酶活迅速下降,60℃時基本失活。在pH為7.0時酶活力最高,在pH 6到pH 9的范圍內(nèi)Chd比較穩(wěn)定,緩沖液中處理30 min后Chd的相對酶活力仍保持95%以上。穩(wěn)定性在pH 7.0時最高。1.0mM Ag+、Al3、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+; 10 mM表面活性劑SDS; 1 mM離子絡(luò)合劑1,10-鄰二氮雜菲；1 mM NBS,0.5mM DEPC強(qiáng)烈抑制了百菌清水解脫氯酶Chd的活性。1.0mM Cr3+、Co2+、Cu2+; 10mM Tween 80、Triton X-100、pCMB、PMSF、PAO和PGO對Chd有較強(qiáng)的抑制作用。而1 mM Zn2+, Ca2+, Ni2+, Mg2+, Li+、Ba2+; 10 mM金屬螯合劑EDTA對Chd僅有程度輕微的抑制(抑制作用小于10%)。 Chd水解百菌清的Km為0.112 mM, kcat值是207s-1,在最佳反應(yīng)條件下的催化效率值為1.8土106 M-1·s-1,這些數(shù)據(jù)表明百菌清是Chd的良好底物。Chd的等電點約為4.13。Chd在自然狀態(tài)下的分子量為33,886 Da,和單體酶的理論計算值基本一致,說明Chd可能是一個單體酶。 對Chd催化百菌清脫氯的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。Chd能被1,10-鄰二氮雜菲完全抑制,而隨后補(bǔ)加Zn2+能恢復(fù)活力,證明Chd是一個金屬酶。Chd能被DEPC完全抑制,羥胺處理后恢復(fù)活力,說明Chd活性位點存在組氨酸殘基。Chd能被NBS完全抑制,但用4-羥基百菌清預(yù)處理后能防止Chd被NBS抑制,說明Chd活性位點存在色氨酸殘基。通過對Chd催化活性位點的定點突變,初步研究了Chd可能的催化機(jī)制。與未突變的野生型Chd相比較,突變體H38Q、H271Q、H326Q、D67A、D215A、D244A、D264A、D323A、C25A、W219F、W227F、W282F、W324F、H283Q、S81T、T150、和E203V對酶活力沒有顯著影響,突變體H63Q和D337A對酶活力有部分影響(30%-50%),而突變體H128Q、H157Q、D45A、D130A、D184A、W241F、S126H和G208A的脫氯活力則完全消失,表明這些位點對酶的催化活性非常關(guān)鍵。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：X172;X592
【圖文】：

圖2一1微生物中已報道的脫鹵反應(yīng)F19.2一1RecentlyexPloreddehalogenationreaetionsinbacterialeultureslogenationof，l，2一dibromoethane，byahaloalkanedehalogenase(DhaAO(PoelarendsetanationofehloroaeetatebyagrouP11dehalogenase(L一DEXorDhlB)(Hilletal.1999).(e)rohydroquinoneduringPentaehloroPhenolmetabolismbytetraehlorohydroquinonedandarajahetal.1999).(d)Initialdehalogenationstepsduringthemetabolismoflindanewodehydrohalogenationsarefollowedbytwoh)，drolytiestePs.(e)Reduetionoftriehlordehalogenase(TRI))(Magnusonetal.2000).(0Theaetivityofortho一ehloroPhennase(CIU〕)(SmidtHetal.2000).化合物微生物降解過程中的關(guān)鍵步驟實際上就是脫鹵作用。在這或輕基基團(tuán)取代化合物的鹵原子。去除鹵原子不僅可以減小鹵代化，而且可以避免后續(xù)代謝過程中形成有毒的中間代謝產(chǎn)物的可轉(zhuǎn)化鹵代化合物過程中，其由于親電性而形成酞鹵化合物或2一鹵成細(xì)胞損傷。從目前的研究來看，微生物脫鹵研究主要在厭氧和

像4一氯苯甲酞一coA脫鹵酶一樣，3一氯一丙烯酸也從spZ雜化的碳原子上取代鹵原子。從尸 seudomonaspavonaceao170中獲得的順式和反式3一氯代丙烯酸脫鹵酶在1，3-二氯丙烯代謝過程中起到重要作用，其在農(nóng)業(yè)上用于去除線蟲等植物病害(圖2一14c)。反式一1，3一二氯丙烯通過鹵代烷脫鹵酶轉(zhuǎn)化之后，產(chǎn)物反式一1一氯一3一輕基丙烯醇氧化而產(chǎn)生反式一3一氯代丙酸酷。CaaD將這個產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛、氯離子和質(zhì)子。接著，丙二酸半醛脫梭反應(yīng)產(chǎn)生乙醛，其可用于一種可替代的生長基質(zhì)。最近，x光結(jié)構(gòu)分析已解決了CaaD酶的自然和無活性的兩種形式 (deJongetal.2003)。該酶是由叩異二聚體而形成的三聚體(圖2一 18a，b)。它的折疊相似于4一草酞巴豆酷互變異構(gòu)體(4一OT)，其屬于互變異構(gòu)酶超家族中的一員，包括異構(gòu)酶和互變異構(gòu)酶 (Whitman2002)。但是

叫CTNc。二etAf妞�！�。grb圖1一2百菌清的濃度與吸光度的相關(guān)曲線Fig.l一 2Curveofrelativityofehlorothalonileoneentrationandabsorbeney2.2降解菌株的菌落形態(tài)及生理生化特征所分離降解菌的菌落、菌體形態(tài)和生理生化指標(biāo)總結(jié)于表1一1菌清平板上形成透明圈(如圖1一3)。從表1一1中可知，所分離的;降解菌株能在百巧株降解菌都為革蘭氏陰性菌，這說明本研究所取污染樣品中，革蘭氏陰性降解菌是占主要優(yōu)勢的。這些菌株的生理生化等特征存在差異，表明具有一定的多樣性。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2806344