發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 15:51

【摘要】：N-雜環(huán)化合物存在于工農(nóng)業(yè)廢棄物中,具有致癌、致畸、致突變等性質(zhì)。尼古丁作為N-雜環(huán)化合物的一種,是高毒性的環(huán)境污染物。利用微生物去除尼古丁等環(huán)境污染物是最為可行的修復(fù)方法。課題組前期分離獲得了一株高效降解尼古丁的菌株——惡臭假單胞菌S16(Pseudomonas putida S16),它采用吡咯途徑代謝尼古丁。然而,假單胞菌屬細(xì)菌代謝尼古丁的吡咯途徑還很不完整:2,5-二羥基吡啶代謝的途徑?jīng)]有被揭示;轉(zhuǎn)化3-琥珀酰吡啶(SP)的關(guān)鍵酶及其基因未知。另外,假單胞菌屬細(xì)菌代謝尼古丁的調(diào)控機(jī)制還沒有被報(bào)道。本論文在前期菌株S16全基因組測(cè)序和比較基因組分析的基礎(chǔ)上,克隆獲得了馬來酸異構(gòu)酶基因iso,在大腸桿菌中異源表達(dá),驗(yàn)證了其編碼產(chǎn)物Pp-Iso為菌株S16中催化尼古丁代謝吡咯途徑最后一步(馬來酸生成富馬酸)的酶。在過去的幾年中,課題組為了尋找尼古丁代謝吡咯途徑中催化3-琥珀酰吡啶(SP)生成6-羥基-3-琥珀酰吡啶(HSP)的酶已作出了很多努力,包括基因組文庫篩選、野生蛋白純化等,但并未獲得目的基因。本論文在菌株S16基因組和差異蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上,通過序列分析定位了菌株S16中編碼轉(zhuǎn)化SP生成HSP酶的基因簇spmABC,其由3個(gè)重疊的基因spmA、spmB和spmC組成。構(gòu)建了spmABC基因簇失活的突變株,在生長(zhǎng)體系和休止細(xì)胞體系中驗(yàn)證了異型多聚體SpmABC的功能為SP羥化酶。然而在大腸桿菌中沒有表達(dá)出有活性的SP羥化酶,分析文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),鉬喋呤胞嘧啶二核苷酸(MCD)是SP羥化酶必不可少的輔因子,而且大腸桿菌不能合成MCD。因此,我們構(gòu)建了spmABC基因簇回補(bǔ)的突變株,并在假單胞菌中成功表達(dá)了有活性的SP羥化酶。尼古丁代謝的生理生化機(jī)制已基本清楚,然而調(diào)控方面的研究開展的很少。本論文以菌株S16中nic2基因簇(包括基因hspB,orf5,iso,hpo,nfo和ami)為研究對(duì)象,研究了尼古丁代謝吡咯途徑的調(diào)控機(jī)制。定位了假單胞菌屬細(xì)菌中第一個(gè)參與尼古丁代謝的調(diào)控基因nicR2,構(gòu)建了基因nicR2失活和回補(bǔ)的突變株,驗(yàn)證其功能為nic2操縱子的阻遏蛋白。凝膠阻滯和DNase I footprinting實(shí)驗(yàn)確定了NicR2的結(jié)合位點(diǎn)包含28 bp的回文序列,其效應(yīng)物是HSP。進(jìn)一步對(duì)菌株S16中調(diào)控蛋白NicR2與DNA的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了研究,通過大分子相互作用實(shí)驗(yàn)確定了兩個(gè)NicR2二聚體協(xié)同結(jié)合到DNA上,并通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)確定了對(duì)NicR2的協(xié)同結(jié)合起到關(guān)鍵作用的DNA序列為(“CTATATGN6~8CATATAA”)。首次證實(shí)了回文序列的半位點(diǎn)(half-site)能夠結(jié)合NicR2,并通過凝膠過濾和蛋白交聯(lián)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到了NicR2四聚體,暗示NicR2蛋白-蛋白之間存在相互作用。在此基礎(chǔ)上,本論文提出了一種新的HTH型調(diào)控蛋白結(jié)合DNA的模型:調(diào)控蛋白以四聚體的形式特異地結(jié)合一個(gè)回文序列,每個(gè)二聚體結(jié)合回文序列的一個(gè)半位點(diǎn)。這種結(jié)合方式不同于其他用HTH結(jié)合DNA的蛋白,反而與某些β-片型調(diào)控蛋白結(jié)合DNA的方式類似。本研究豐富了原核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多樣性。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X172
【圖文】：

4圖 1.1 微生物分解代謝尼古丁的途徑[7, 8, 27]途徑 A 是節(jié)桿菌屬微生物采用的吡啶途徑；途徑 B 是假單胞菌屬微生物采用吡咯途徑；途徑 C 是推測(cè)的根癌農(nóng)桿菌分解代謝尼古丁的吡啶-吡咯雜合途徑。Fig 1.1 The pathways of nicotine catabolism in bacteria.

圖 1.2 節(jié)桿菌中尼古丁代謝相關(guān)基因（簇）[7]ORF 下方的數(shù)字代表其編碼蛋白的氨基酸數(shù)量Fig. 1.2 Arrangement of genes involved in nicotine catabolism on megaplasmid pAO1.2. 假單胞菌屬細(xì)菌代謝尼古丁分子生物學(xué)研究假單胞菌屬細(xì)菌代謝尼古丁吡咯途徑的分子機(jī)制直到近年來才取得突破。其

只有噬尼古丁節(jié)桿菌 pAO1 中的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（圖1.3）。1. HdnoR節(jié)桿菌中代謝L-尼古丁的第二步反應(yīng)是由6-羥基-L-尼古丁氧化酶6HLNO催化的，該酶只能催化 L-型對(duì)映體的降解，然而在該菌株中，L-型尼古丁也能夠誘導(dǎo) 6hdno 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。6hdno 基因位于大質(zhì)粒 pAO1 上 ORF111 和 ORF113之間，這兩個(gè) ORF 都編碼透性酶。RT-PCR 和引物延伸實(shí)驗(yàn)都表明 6hdno 基因單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)操縱子，而且是誘導(dǎo)型表達(dá)的。6hdno 下游的 ORF114 編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2796421