【摘要】：久效磷農藥是聯合國環(huán)境規(guī)劃署優(yōu)先控制污染物之一，已有研究證實久效磷農藥對金魚、斑馬魚等硬骨魚具有雌激素效應，而擾亂魚體內性激素含量是其發(fā)揮雌激素效應的關鍵。魚類性激素的合成既受到其性激素生成途徑中相關蛋白和酶類的影響也受到下丘腦-垂體-性腺軸中上游神經系統的調控。為了避免體內實驗中來自內分泌軸線各個器官之間的作用，本文以虹鱒魚性腺細胞系(RTG-2cells)為實驗材料，研究久效磷農藥暴露條件下細胞培養(yǎng)基中性激素的濃度和性激素生成相關蛋白和關鍵酶的表達水平，以說明久效磷農藥是否能通過性激素生成途徑影響性激素的合成；同時，從蛋白激酶A(PKA)/蛋白激酶C (PKC)兩條信號途徑在久效磷農藥調控性激素生成相關基因表達中的作用以及久效磷農藥暴露下胞內cAMP含量和PKA活性的變化兩方面，研究久效磷農藥對性激素生成相關基因表達的調控，從激素水平、基因表達和信號途徑三個層次，探討久效磷農藥干擾性激素水平影響性激素生成途徑的作用機制。 本文研究結果表明： (1)久效磷農藥對RTG-2細胞的48h IC50為243.80μg/L，當濃度小于160μg/L時，細胞的成活率不受久效磷農藥的影響，通過對細胞內乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶三種酶活性的檢測發(fā)現，所選擇的久效磷農藥暴露濃度對細胞生長沒有影響。 (2)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農藥暴露細胞48h，采用放射免疫分析法檢測了培養(yǎng)基中性激素的含量，結果表明，對照組和0.1μg/L久效磷農藥暴露組細胞培養(yǎng)基中雌激素(17β-estradiol, E2)含量低于培養(yǎng)基中雌激素的初始含量，而1.0和10.0μg/L久效磷農藥暴露組細胞培養(yǎng)基中E2含量顯著高于初始濃度和對照組濃度；久效磷農藥各處理組培養(yǎng)基中睪酮濃度均低于培養(yǎng)基中睪酮的初始濃度，表明久效磷農藥能夠干擾RTG-2細胞的性激素合成，促進了RTG-2細胞合成分泌E2。 (3)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農藥暴露細胞48h，采用熒光實時定量PCR (real-time PCR)的方法檢測性激素生成相關的蛋白和關鍵酶的表達水平。結果表明，各濃度久效磷農藥對性激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenic acuteregulatory protein, StAR)的表達水平無影響，1.0和10.0μg/L久效磷農藥使膽固醇側鏈裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme, CYP11A1)和17α羥化酶(cytochrome P45017alpha-hydroxylase, CYP17)的表達增加，0.1、1.0和10.0μg/L久效磷農藥促進了性腺芳香化酶P450(cytochrome P450aromatase, CYP19A)的轉錄表達，說明久效磷農藥可以通過提高性激素生成相關基因的表達水平來影響性激素的合成。 (4)基于前一部分研究，選擇影響基因表達的10.0μg/L做為久效磷農藥暴露濃度，同時設置PKA抑制劑和PKC抑制劑與久效磷農藥聯合暴露，暴露48h后，利用real-time PCR的方法檢測StAR、CYP11A1、CYP17和CYP19A的表達。結果表明PKA抑制劑與久效磷農藥聯合暴露組，CYP11A1、CYP17和CYP19A的表達顯著低于10.0μg/L久效磷農藥暴露組，而PKC抑制劑對各基因的表達無影響，說明久效磷農藥對各基因的表達調控是通過PKA途徑進行的。 (5)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷農藥暴露細胞，分別在暴露0.5h、2h、4h、8h、24h和48h取樣，用酶聯免疫分析的方法檢測細胞內cAMP濃度隨暴露時間和暴露濃度的變化，結果表明除1.0μg/L，其它濃度久效磷農藥在暴露后4h內均使cAMP濃度上升；用非放射性檢測系統檢測久效磷農藥暴露4h后PKA活性的變化，發(fā)現1.0、10.0和100.0μg/L久效磷農藥使細胞內PKA活性增強，證明久效磷農藥對cAMP/PKA途徑具有促進作用。 綜上所述，本文從性激素含量、調控性激素合成的關鍵酶基因表達水平和調控基因表達的信號途徑三個層次，研究了久效磷農藥對性激素生成途徑的干擾作用與機制，結果表明久效磷農藥通過對cAMP/PKA信號途徑的促進作用，提高了性激素生成關鍵酶基因的表達水平，最終使性激素的合成分泌增加。本文首次提出久效磷農藥調控性激素生成相關基因是通過活化cAMP/PKA這一信號途徑介導的，并通過對性激素生成關鍵酶基因的表達水平的影響來調控性激素的合成，這為與久效磷農藥同類型不能與雌激素受體結合的雌激素效應化合物的作用機制研究提供了參考，也為久效磷農藥發(fā)揮的多種毒性效應和其他內分泌擾亂作用提供了理論基礎。
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X174

【參考文獻】

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1 ;Effects of 3,4-DichIOrOaniline on Testicle Enzymes as Biological Markers in Rats[J];Biomedical and Environmental Sciences;2009年01期

本文編號：2775236