【摘要】：自上世紀(jì)中期被推入市場以來,取代脲類除草劑在世界范圍內(nèi)被廣泛施用,成為除草劑大家庭中一個重要成員。然而,隨著該類除草劑的持續(xù)施用,其殘留的環(huán)境危害也逐漸凸顯,取代脲類除草劑及其代謝產(chǎn)物被證明對微生物、植物、動物及人類都有毒害作用。因此,取代脲類除草劑的吸附、遷移和分解等環(huán)境行為備受關(guān)注。在自然條件下,微生物在該類除草劑的降解過程中發(fā)揮著主要作用,所以,取代脲除草劑的微生物降解及其分子機理是研究的熱點。根據(jù)苯環(huán)上取代基差異,取代脲類除草劑可分為N,N二甲基取代脲類除草劑和N-甲氧基-N-甲基取代脲類除草劑兩類。目前,已報道有幾十株能降解取代脲類除草劑的微生物,且能夠礦化N-甲氧基-N-甲基取代脲類除草劑的微生物主要來自Variovorax屬細(xì)菌,而能夠礦化N,N-二甲基取代脲類的則都是sphingomonads(屬Sphingomonas、Novosphingobium、Sphingopyxis和Sphingobiu 被統(tǒng)稱為 sphingomonads)。Variovorax屬細(xì)菌礦化N-甲氧基-N-甲基取代脲類的途徑和分子機理已經(jīng)被闡明,sphingomonads礦化N,N二甲基取代脲類的途徑基本清楚,但相關(guān)分子機理還處于空白。在前期的工作中,本實驗室分離到一株能夠礦化N,N-二甲基取代脲的菌株Sphingobium sp.YBL2,該菌降解N,N-二甲基取代脲類的途徑為:依次從N基團上脫甲基,繼而是脲橋的斷裂,最后生成的苯胺化合物開環(huán)降解。本論文主要以菌株YBL2以及N,N-二甲基取代脲類除草劑的代表異丙隆(IPU)為研究材料,闡明了 sphingomonads礦化N,N-二甲基取代脲類除草劑的分子機理。具體工作可分為以下三個方面。一、Sphingobium sp.YBL2中脫甲基酶基因pdmAB的克隆及功能驗證研究表明,YBL2等微生物對N,N-二甲基取代脲類除草劑降解的起始步驟是脫甲基,該步驟被認(rèn)為是底物降解的限速步驟。本研究利用轉(zhuǎn)座子隨機插入突變的方法構(gòu)建文庫,從YBL2中克隆到基因pdmAB。PdmAB能夠?qū),N-二甲基取代脲類除草劑脫一個甲基。比對后發(fā)現(xiàn),PdmAB是Rieske非血紅素鐵加氧酶系統(tǒng)(ROs)中加氧酶組分,其中pdmA編碼α亞基,pdmB編碼β亞基。pdmAB被兩個序列完全相同的轉(zhuǎn)座酶基因包圍,在從不同地區(qū)分離的取代脲類降解菌中這一轉(zhuǎn)座單元高度保守。ROs通常由加氧酶組分和電子傳遞鏈組分組成,序列分析發(fā)現(xiàn)在加氧酶PdmAB基因周圍沒有電子傳遞鏈組分。將PdmAB在大腸桿菌、假單胞菌和其它的sphingomonads中表達(dá)都檢測到了異丙隆的降解活性。兩個[3Fe-4S]-type的鐵氧化還原蛋白(一個來自于RW1的Fd34-1和一個來自于YBL2的Fd2750)分別與PdmAB在大腸桿菌中共表達(dá),顯著的提高了 PdmAB的活力。上述結(jié)果表明,PdmAB對電子傳遞鏈組分的需求不是特異性的,并且其對應(yīng)的鐵氧化還原蛋白應(yīng)是[3Fe-4S]-type。PdmA與先前已經(jīng)報道的加氧酶的α亞基同源性較低(37%),系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)其不與催化O-和N-上脫甲基的加氧酶成一簇,表明PdmAB是一個新的脫甲基酶。二、水解酶基因ddhA的克隆、表達(dá)及其酶學(xué)特性的研究通過對野生型菌株YBL2和突變株YBL2-Mut全基因組測序比對,我們成功的克隆到了 DDIPU的水解酶基因,命名為ddhA。基因ddhA含有2139個堿基,編碼712個氨基酸,G+C含量為47.5%。將基因ddhA在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中比對,未發(fā)現(xiàn)與ddhA同源的DNA序列。比對后發(fā)現(xiàn),在已報道的蛋白序列中,DdHA僅與來自于西維因降解菌Rhizobium sp.AC100的水解酶CehA(BAB85626)有一定的同源性,為14%。通過親和層析對融合蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),DdhA大小約80kDa。通過HPLC和MS/MS方法,鑒定了 DdhA催化1-對異丙基苯基脲(DDIPU)水解的產(chǎn)物為對異丙基苯胺(4IA)。酶學(xué)特性研究結(jié)果表明DdhA的最適酶促反應(yīng)溫度為35℃,最適pH為7.0,1 mM的Hg2+、Cu2+和Zn2+能強烈抑制DdhA的酶活。同時我們也研究了 DdhA的底物譜。結(jié)果表明DdhA除了可以降解DDIPU外,還可以降解1-(4-異丙基苯基)-3-甲基脲(MDIPU)和對氯苯基脲,產(chǎn)物分別為4IA和對氯苯胺。DdhA能夠直接降解MDIPU,說明在YBL2降解異丙隆的過程中,生成的中間代謝產(chǎn)物MDIPU可能有兩條路徑代謝:一是進(jìn)一步的脫甲基生成DDIPU;另一條代謝途徑就是直接斷脲橋生成4IA。這一結(jié)果表明,在YBL2降解異丙隆的過程中,DdhA主要是負(fù)責(zé)催化中間代謝產(chǎn)物MDIPU和DDIPU脲橋的斷裂,PdmAB和DdhA一起作用可以將異丙隆轉(zhuǎn)化成苯胺的衍生物。對氯苯基脲與DDIPU結(jié)構(gòu)類似,為取代脲除草劑滅草隆的兩步脫甲基產(chǎn)物,DdhA能夠降解對氯苯基脲,結(jié)合在幾株異丙隆降解菌株中該基因高度保守這一特性,說明DdhA可能是微生物以典型途徑降解N,N-二甲基這一類取代脲除草劑的關(guān)鍵基因,對此類除草劑的降解有重要的理論意義。同時我們還發(fā)現(xiàn),DdhA能夠降解氨基甲酸類除草劑西維因和呋喃丹,生成產(chǎn)物分別為α-萘酚、呋喃酚。三、取代脲類除草劑降解菌株的分離鑒定及其降解異丙隆和利谷隆的代謝途徑本研究還通過富集培養(yǎng)的方法,從長期生產(chǎn)取代脲類除草劑工廠的污泥中分離篩選出一株能夠同時降解N,N-二甲基取代脲類除草劑異丙隆和N-甲氧基-N-甲基取代脲除草劑利谷隆的菌株,命名為Pu21。經(jīng)形態(tài)、生理生化特性測定及其16S rRNA基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析,該菌株被鑒定為Sphingobium.sp.。到目前為止,已報道的取代脲除草劑的降解菌株很多,但是能夠同時且高效降解兩類除草劑的菌株鮮有報道。通過連續(xù)取樣,經(jīng)HPLC和MS/MS分析,鑒定了菌株降解異丙隆和利谷隆的代謝途徑。菌株對異丙隆的降解首先是通過一步的脫甲基生成MDIPU,MDIPU可以脫甲基生成DDIPU,DDIPU斷脲橋生成4IA,MDIPU也可以直接斷脲橋生成4IA,生成的4IA可以進(jìn)一步的降解。對利谷隆的降解則是直接斷脲橋,生成的3,4-DCA在代謝過程中沒有積累,也能夠被菌株繼續(xù)降解。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X172
【圖文】：

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本文編號：2764157