【摘要】：細菌細胞形態(tài)主要取決于細胞生長、細胞分裂和細胞周期。細胞生長主要是細胞結構組分的生物合成和核酸復制。細胞分裂包括細胞壁和細胞膜的重建與分隔,以及遺傳物質的分離。細胞周期則涉及到基因表達的時空特異性、蛋白定位和蛋白形式的調控。典型模式細菌Bacillus subtilis和Escherichia coli形態(tài)形成的分子機理已經成為細胞學研究的熱點。但是,對于具有豐富多樣性的環(huán)境微生物的細胞形態(tài)形成規(guī)律、分子機制以及對應的生理功能,仍有待研究。本文研究一株從多溴聯(lián)苯醚污染的河流底泥中富集分離到的、具有獨特絲狀-桿狀細胞形態(tài)變化周期的芽胞細菌(編號GY32),系統(tǒng)開展了該菌對十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的生物轉化作用、分類鑒定、細胞周期模型構建、基因組學、比較基因組學以及特殊細胞形態(tài)變化的轉錄組學等研究,主要得出了如下結果:菌株GY32的生物修復潛力研究證實其具有吸附和轉化十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的能力。菌株GY32活細胞和死菌體的吸附能力測定證實兩種情況吸附BDE209的量分別為18.43和13.05μg L-1。比較好氧、厭氧以及兼性厭氧條件下一個月內該菌株對BDE209的轉化率,結果顯示:在初始濃度為0.6μmol L-1時,該菌在厭氧和兼性厭氧條件下的BDE209去除率分別為31.7%和56.9%,而好氧體系中未見明顯的BDE209減量。本研究為進一步研究開發(fā)兼性厭氧條件下菌株GY32對BDE209污染修復的應用潛能提供了參考。菌株GY32的分類學研究確定其為賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)的新種。形態(tài)學、生理生化指標、化學指標以及分子鑒定等多相分類研究結果顯示,菌株GY32具有與同屬菌種相似的一般生理生化特征,如生長條件、V-P試驗、細胞壁氨基酸類型、脂肪酸組成、醌型等,但是具有不同于屬內其他菌種的特殊細胞形態(tài)變化周期、碳源利用譜、硝酸鹽還原陽性及氧化酶測定陰性等特征,與屬內近緣菌種的(G+C)mol%差異約為5%,DNA-DNA雜交率為52.1%。上述差異特征顯示該菌為Lysinibacillus屬的一個新種,定名為變形賴氨酸芽胞桿菌(Lysinibacillus varians)。菌株GY32分類地位的確定不僅豐富了Lysinibacillus屬的組成,還為進一步開展此類環(huán)境微生物的其他研究,如潛在的生理功能和特定表型的分子基礎提供了參考。基于菌株GY32的形態(tài)學研究確定了絲狀-桿狀細胞形態(tài)的變化過程并構建了此類菌株的細胞周期模型。本研究通過純芽胞收集、調節(jié)培養(yǎng)物稀釋倍數、摸索芽胞萌發(fā)條件,結合單個細胞發(fā)育實時在線觀察技術,記錄了從芽胞膨脹萌發(fā)到細胞長成絲狀再到分裂成桿狀直至再次形成芽胞的完整過程。芽胞在30℃條件下孵育2 h后,從芽胞萌發(fā)到再次形成芽胞的約33 h的細胞周期大致分為七步:(i)芽胞歷時約4.5 h膨大、出芽;(ii)芽在約2.0 h內生長為桿狀細胞(10μm)并脫離芽胞外殼;(iii)桿狀細胞在約1.5 h內,不發(fā)生細胞分裂而是快速生長成絲狀細胞(~466.1μm);(iv)絲狀細胞開始不對稱二分裂。母細胞與子細胞同時繼續(xù)生長,體系中細胞形態(tài)維持在大于10μm的絲狀,這個過程約3.0 h;(v)之后的約5.0 h內,絲狀細胞生長到約原始長度的2倍時,就不對稱地二分裂,體系中絲狀和少量新分裂出的桿狀細胞共存。部分從芽胞萌發(fā)開始一直未分裂的絲狀細胞開始自溶;(vi)桿狀細胞比例越來越高,約12 h之后以長度為5.0~10.0μm的桿狀細胞為主;(vii)約5.0 h后,體系內全為桿狀細胞,并且開始形成內生芽胞。菌株GY32代表了不同于常規(guī)桿菌和球菌的新型的細胞形態(tài)變化周期,相應的模型為進一步開展這類細菌的細胞形態(tài)形成分子機理奠定了基礎。菌株GY32的基因組學研究確定了與該菌細胞形態(tài)形成相關的基因。通過全基因組序列測定,發(fā)現(xiàn)菌株GY32基因組由一個環(huán)狀染色體構成�；蜃⑨尳Y果顯示該基因組中存在的雙組份系統(tǒng)基因、轉錄調節(jié)因子及Sigma因子等起調節(jié)作用的基因是特定表型表達調控的基礎;基因組中存在的細胞分裂相關基因與已知基因的同源性很高,但是其中同源基因的拷貝數有差異;基因組中具有不同于近緣菌種的細胞隔膜合成基因;移動遺傳元件為該基因組引入了新的細胞壁合成基因。這些直接與細胞分裂和細胞調控相關的基因是Lysinibacillus varians GY32形態(tài)變化的遺傳基礎。比較基因組和轉錄組學分析分別提供了GY32特有的細胞形態(tài)形成相關基因以及絲狀向桿狀細胞形態(tài)轉變時相關基因的轉錄水平存在顯著差異的證據。菌株GY32中1300個與參比基因組同源性低的基因分別與轉錄、信號傳遞機制、細胞壁/細胞膜/細胞包被形成、碳水化合物轉運和代謝、氨基酸轉運和代謝等方面的功能相關。其中與細胞分裂位點選擇相關的fts L、div IC、ded D、與分裂體錨定細胞膜相關的sep F、與染色體復制和分離相關的par A、par B、與細胞壁和細胞膜合成相關的cwl K、pbp2B、maf B-like、fts E、fts X在菌株GY32的絲狀和桿狀兩種細胞中的轉錄水平具有顯著差異,上述基因表達上調是細胞分裂加劇的分子基礎。而fts Z轉錄水平未見顯著差異則表明在兩種細胞形態(tài)下分裂體的關鍵骨架(Fts Z多聚體)組裝未受影響。核酸染色和轉錄組分析結果相結合顯示絲狀細胞形態(tài)中分裂位點能順利定位,分裂體骨架也可以正常組裝,但是由于sep F表達量低,Fts Z多聚體未能錨定到細胞膜,不能實現(xiàn)進一步細胞分裂。本論文的相關研究發(fā)現(xiàn)并確立了一個具有特殊絲狀-桿狀細胞形態(tài)變化周期的賴氨酸芽胞桿菌新種,構建了此類菌的細胞周期模型,明確了該菌基因組中細胞形態(tài)形成相關基因的組成和特異的目標基因的表達情況。本研究的結果初步證實在Lysinibacillus varians GY32從芽胞萌發(fā)至形成絲狀過程中,由于分裂體骨架未能錨定到細胞膜并提供細胞內縊的力,導致細胞不分裂而是持續(xù)伸長。而起錨定作用的sep F的表達上調,配合相應細胞隔膜形成基因的上調表達,直接引起了細胞形態(tài)由絲狀向桿狀變化。顯然,確定此類菌細胞形態(tài)形成的分子機制細節(jié)還有很長的路要走,但現(xiàn)有研究提供了初步的實驗證據,為進一步開展細胞分裂活動的抑制和解抑制、細胞周期的調控、以及開發(fā)菌株GY32對BDE209的降解功能奠定了基礎。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X172

【參考文獻】

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本文編號：2751243