發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 11:04

【摘要】：環(huán)境污染導(dǎo)致重金屬、藻毒素和持久性有機(jī)污染物等有毒物質(zhì)在自然水體中大量積累,嚴(yán)重威脅魚類和其它水生生物的生存,并可通過飲用水和食物鏈等渠道危害人類健康。ABCB1和ABCC4屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員,作為多毒物耐受的主要因子,在毒物排泄、組織防御和信號(hào)傳導(dǎo)等方面有著重要的生理學(xué)作用。研究表明斑馬魚abcb4和abcc4基因是哺乳動(dòng)物ABCB1和ABCC4直系同源基因,也可能具有識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)多種毒物的功能。目前,對魚類abcb4和abcc4基因在微囊藻毒素(Microcystin-LR, MC-LR)或有機(jī)氯類農(nóng)藥DDT和lindane解毒和排泄中的功能研究還很少。本研究克隆了斑馬魚abcb4和abcc4基因的編碼序列,建立了穩(wěn)定表達(dá)斑馬魚Abcb4及其顯性失活體Abcb4-G1177D, Abcc4及其顯性失活體Abcc4-G1188D的LLC-PK1細(xì)胞系,并研制出有效整合的轉(zhuǎn)abcc4基因斑馬魚品系,為探討過表達(dá)斑馬魚abcb4和abcc4基因在毒物解毒和排泄中的分子功能及其作用機(jī)理提供細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。取得的研究結(jié)果如下：1.本研究證實(shí)了斑馬魚Abcb4介導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞和斑馬魚胚胎對MC-LR外排的生理功能。檢測了abcb4基因在成體斑馬魚各組織中的表達(dá)情況,其中以腸道的表達(dá)量最高。MC-LR處理可顯著誘導(dǎo)斑馬魚abcb4基因在96-hpf幼體中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。過表達(dá)斑馬魚abcb4基因能明顯降低MC-LR的毒性效應(yīng)及在LLC-PK1細(xì)胞和斑馬魚胚胎內(nèi)的積累。其顯性失活體Abcb4-G1177D沒有轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性,但具有與底物結(jié)合的能力,可競爭性抑制內(nèi)源性斑馬魚Abcb4的功能。過表達(dá)斑馬魚Abcb4-G1177D顯著降低了胚胎對MC-LR的耐受能力。此外,MC-LR也能誘導(dǎo)斑馬魚胚胎內(nèi)ATPase活性的升高。從這些結(jié)果推測斑馬魚abcb4基因可能是環(huán)境水體中藻毒素污染的敏感基因,參與魚類對藻毒素的解毒過程。2.DDT和lindane是一類具有劇毒的有機(jī)氯類農(nóng)藥,通常在一些發(fā)展中國家使用頻繁,從而對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本研究證實(shí)了斑馬魚Abcc4具有介導(dǎo)LLC-PK1細(xì)胞和斑馬魚胚胎對DDT和lindane外排的生理功能。研究結(jié)果顯示DDT或lindane能顯著誘導(dǎo)斑馬魚abcc4 mRNA的上調(diào)表達(dá)。過表達(dá)斑馬魚abcc4基因能大幅度增強(qiáng)LLC-PK1細(xì)胞和斑馬魚胚胎對DDT和lindane的耐受能力和外排能力。其顯性失活體Abcc4-G1188D可競爭性抑制內(nèi)源性Abcc4的功能,將其過表達(dá)后提高了DDT和lindane對LLC-PK1細(xì)胞和斑馬魚胚胎的毒性。此外,DDT或lindane處理也能顯著誘導(dǎo)谷胱甘肽(GSH)和ATPase活性的升高。以上結(jié)果表明斑馬魚Abcc4可能是介導(dǎo)有機(jī)氯類農(nóng)藥DDT和lindane解毒和排泄的重要因子。3.本研究還采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)并結(jié)合SB (Sleeping Beauty)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)研制轉(zhuǎn)abcc4基因斑馬魚品系。首先構(gòu)建了“全魚”序列的轉(zhuǎn)基因載體,即啟動(dòng)子和PolyA序列均來自鯉魚β-肌動(dòng)蛋白基因,在abcc4編碼序列的終止子引入了Flag標(biāo)簽序列用于表達(dá)分析。PO代轉(zhuǎn)abcc4基因斑馬魚陽性率為22.1%,并獲得了3條可通過性腺傳遞的P0代陽性個(gè)體。將這3條P0代親本分別與野生型魚配對繁殖,F1代陽性魚篩選的比率分別是43.75%、47.22%和52.08%。qPCR和Western Blotting結(jié)果表明有2尾F1代陽性魚能夠有效表達(dá)。通過F2代有效整合的陽性魚自交,獲得了一尾轉(zhuǎn)abcc4基因純合魚品系。綜上所述,斑馬魚abcb4和abcc4基因能被微囊藻毒素及有機(jī)氯類農(nóng)藥DDT或lindane誘導(dǎo)表達(dá),過表達(dá)后介導(dǎo)多毒物耐受的生理功能,并促進(jìn)LLC-PKl細(xì)胞和斑馬魚胚胎對這些有毒物質(zhì)的外排。此外,通過過表達(dá)細(xì)胞系的建立,結(jié)合研制出有效表達(dá)的轉(zhuǎn)abcc4基因斑馬魚品系,為后續(xù)深入開展斑馬魚Abcb4和Abcc4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗毒物積累排泄的功能及其作用機(jī)制提供模型。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X171.5;Q78
【圖文】：

逑眼、鮑、精巢、卵巢、肝臟、腸道、腎臟、心臟和肌肉進(jìn)行了定量ＰＣＲ分析。逡逑結(jié)果顯示（如圖１．１），＾＾６６６４基因的轉(zhuǎn)錄本幾乎在所檢測的成體組織中都有表達(dá)，逡逑是一個(gè)泛組織表達(dá)的基因。其中以腸道和肝臟的表達(dá)量最高，其次是肌肉、鮑、逡逑眼和卵巢，在精巢、腎臟、心臟和中的表達(dá)量最低。這些結(jié)果表明斑馬魚〃６＾：６４逡逑基因可能在成體斑馬魚的某些組織或器官中（如腸道和肝臟）具有重要的生理學(xué)逡逑作用。逡逑１６０逡逑ｃ邋１４０邋■逡逑０逡逑？邋１２０邋．逡逑Ｈｉ逡逑ＣＯ逡逑１００邋？逡逑ｏ２邐Ｔ逡逑Ｉ邋§邋？邐Ｉ逡逑，卜邋Ｉ逡逑＾邋４０邋■邐■逡逑＾邋２０邋“邋■逡逑Ｑ邐－邋Ｉ邐ｔ邐ｔ邐—１＿Ｊ６Ｌ＿Ｉ＿＾Ｌ－Ｊ逡逑圖１．１邋ｆｌＡｃＷ基因在成體斑馬魚各個(gè)組織中的表達(dá)情況。ｂｒａｉｎ：腦；ｅｙｅ；眼；ｇｉｌｌ：逡逑魚思；ｈｅａｒｔ：心臟；ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：腸道；ｌｉｖｅｒ：肝臟；ｍｕｓｃｌｅ：肌肉；ｋｉｄｎｅｙ：腎臟；逡逑ｏｖａｒｙ；卵巢；ｔｅｓｔｉｓ：精巢。所有組織都取自３尾（心臟和腎臟取自１０尾）性成逡逑熟斑馬魚的混合樣品。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（ｎ＝３）表示。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｚｅｂｒａｆｉｓｈ邋ａｂｃｂ４邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋ａｄｕｌｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．邋Ｂｒａｉｎ，逡逑ｅｙｅｓ

ｍＲＮＡ的誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示（如圖Ｌ２Ｄ），Ｏ．Ｏｌ－ｌＯｎｇ／Ｌ邋ＭＣ－ＬＲ處理２４－９６ｈｐｆ逡逑斑馬魚胚胎都能顯著誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，誘導(dǎo)效率依次呈１．４１，１．７９逡逑和２．１０倍遞增。整體原位雜交的結(jié)果表明（如圖１．２Ｅ），與對照組相比，Ｏ．Ｏｌ＾ｉｇ／Ｌ逡逑ＭＣ－ＬＲ處理能明顯誘導(dǎo)ａｂｃｂ４基因在９６邋ｈｐｆ斑馬魚胚胎腸道中的高表達(dá)。逡逑０邋Ｏ－Ｏｆ邋０．１邋１邋Ｗ邐０邐０．０１邐１邐１０逡逑。丨Ｕ邋Ｍ逡逑０邋０．０１邋０．１邋１邋１９邐０邋０．０１邋０，１邋１邋１０逡逑ＭＣ－ＬＲ邋（Ｊｉｇ／ｔ）邐ＭＣ－ＬＨ邋（Ｍ９／Ｍ逡逑ＣＫ邐Ｉ逡逑圖１．２微囊藻毒素對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響及對ａｂｃｂ４基因的誘導(dǎo)表達(dá)。（Ａ）逡逑０－１邋Ｏ＾ｇ／Ｌ邋ＭＣ－ＬＲ處理２４ｈｐｆ胚胎，統(tǒng)計(jì)９６ｈｐｆ的出膜率。（Ｂ邋）畸形率的統(tǒng)計(jì)。（Ｃ邋）逡逑成活率的統(tǒng)計(jì)。（Ｄ）ＩＯＯ粒２４ｈｐｆ斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的ＭＣ－ＬＲ至９６ｈｐｆ，逡逑ｑＰＣＲ檢測９６ｈｐｆ邋ｆｌｋｒＷ基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。（Ｅ）整體原位雜交檢測逡逑０．０１＾ｌｇ／Ｌ＾＾Ｃ－ＬＲ對斑馬魚胚胎＾７６６＾從基因組織特異性的誘導(dǎo)表達(dá)。ＣＫ表示未用逡逑ＭＣ－ＬＲ處理的對照胚胎，黑色箭頭指示的腸道的表達(dá)信號(hào)。數(shù)據(jù)表示平均值±逡逑標(biāo)準(zhǔn)偏差，ｎ＝３。＇？表示／）＜０．０１，邋＊表示／？＜０．０５。逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＭＣ－ＬＲ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｈａｔｃｈｉｎｇ，邋ａｂｎｏｒｍａｌ邋ａｎｄ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅｓ邋ａｎｄ逡逑ｚｅｂｒａｆｌｓｈ邋ａｂｃｂ４邋ｇｅｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｖｅｌｏｐｉｎ

的轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)。將不同濃度的ＭＣ－ＬＲ和０．５＾ｉＭ邋Ｒｈ－１２３共同處理過表達(dá)ＧＦＰ、Ａｂｃｂ４逡逑和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎，２８°Ｃ避光孵育４０ｍｉｎ后酶標(biāo)儀測定Ｒｌｉ－１２３在胚胎中的逡逑積累量。如圖１．４Ｂ結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)液中ＭＣ－ＬＲ劑量的增大，過表達(dá)ＧＦＰ、逡逑Ａｂｃｂ４、和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎內(nèi)Ｒｈ－１２３的含量均明顯上升，當(dāng)ＭＣ－ＬＲ的添加逡逑量在Ｏ．ｌ－ｌＯｎｇ／Ｌ范圍內(nèi)時(shí)，Ｒｈ－１２３在過表達(dá)ＡｂｃＭ胚胎中的積累量顯著高于在逡逑過表達(dá)ＧＦＰ和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎中的積累量。另外，過表達(dá)Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ逡逑胚胎中Ｒｈ－１２３的含量在ＭＣ－ＬＲ處于ｌ－１０＾ｌｇ／Ｌ范圍內(nèi)時(shí)，均顯著高于過表達(dá)ＧＦＰ逡逑胚胎中的含量。這些結(jié)果表明ＭＣ－ＬＲ可能作為斑馬魚Ａｂｃｂ４新的結(jié)合底物

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 Qilin Gu;Xiaojie Yang;Xiaozhen He;Qing Li;Zongbin Cui;;Generation and Characterization of a Transgenic Zebrafish Expressing the Reverse Tetracycline Transactivator[J];Journal of Genetics and Genomics;2013年10期

2 張霖琳;梁宵;魏復(fù)盛;;汀江某河段底泥中重金屬含量的測定及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)[J];環(huán)境化學(xué);2012年07期

3 王莉霞;郭朝暉;肖細(xì)元;陳同斌;廖曉勇;宋杰;武斌;;湘江中下游農(nóng)田土壤和蔬菜的重金屬污染(英文)[J];Journal of Geographical Sciences;2008年03期

4 ;Relationship Between Microcystin in Drinking Water and Colorectal Cancer[J];Biomedical and Environmental Sciences;2002年02期

5 朱作言,許克圣,謝岳峰,李國華,何玲;轉(zhuǎn)基因魚模型的建立[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1989年02期

本文編號(hào)：2746455