【摘要】：全氟烷基化合物(簡稱全氟化合物)是一類廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活的化合物,具有化學(xué)和熱穩(wěn)定性強(qiáng),不易被生物降解的特點(diǎn),具有環(huán)境持久性。與傳統(tǒng)的持久性有機(jī)污染物不同,全氟化合物是兩性分子,水溶性好,而且分子當(dāng)中不含苯環(huán),因此在環(huán)境分布、生物代謝和毒性機(jī)制上均和傳統(tǒng)的有機(jī)污染物有所區(qū)別。研究已經(jīng)證明,肝臟是全氟化合物的主要靶器官,但是目前全氟化合物的致毒機(jī)理尚不明確,對雌雄動(dòng)物的毒害差異研究開展較少,對其生物有效性研究也是空白。本論文針對具有代表性的全氟化合物——全氟辛酸,使用小鼠體內(nèi)模型與模擬胃腸法的體外模型對照,研究其在不同食物中的生物有效性,及食物組分對其生物有效性的影響。并對全氟辛酸和另一種人體常見的全氟化合物——全氟己烷磺酸,在雌雄小鼠體內(nèi)造成的肝臟毒性進(jìn)行系統(tǒng)研究,使用蛋白組學(xué)方法研究其致毒的分子機(jī)制。全文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：對于在氟化工園區(qū)附近居民而言,全氟辛酸的主要暴露來源之一就是通過食物攝入。為此,我們對全氟辛酸的食物中生物有效性進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示全氟辛酸在食物中的生物有效性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于通過飲水獲得的暴露,油脂可以減小全氟辛酸的生物有效性。同時(shí)我們采用三種體外方法測定其生物可用性。結(jié)果顯示,來自歐盟組織的UBM方法測定的生物可用性和小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為吻合,可以作為預(yù)測食物中全氟辛酸的生物有效性的體外方法。全氟辛酸與傳統(tǒng)有機(jī)污染物的腸道吸收模式有明顯的差異,油脂分解產(chǎn)生的脂肪酸,可能飽和腸道的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶,造成全氟辛酸的吸收效率低下；另外在脂肪酸消化過程中,腸液的Zeta電位出現(xiàn)了下降,造成膠束的不穩(wěn)定,引發(fā)兩性化合物(如全氟辛酸和脂肪酸等)的凝絮,從而降低全氟辛酸在腸液中的濃度,進(jìn)一步減少腸道吸收。前人的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,全氟辛酸暴露于小鼠后,主要蓄積于肝臟和血液中,并引發(fā)肝毒性,但是對于全氟辛酸造成小鼠肝凋亡的機(jī)制和雌雄小鼠的毒性差異還沒有深入研究。在本研究中,我們將全氟辛酸以0.05、0.5和2.5 mg/kg/day的低中高劑量分別暴露于雌/雄性小鼠28天后,最高濃度組小鼠出現(xiàn)體重的顯著性下降。化學(xué)分析顯示,全氟辛酸會(huì)蓄積在小鼠的肝臟和血液中,引發(fā)肝臟的腫大和病變的產(chǎn)生,腫大趨勢隨暴露劑量的增加而增強(qiáng),在同一暴露濃度下,雌性小鼠中肝重增加更多。病理切片顯示,肝臟發(fā)生肝細(xì)胞腫脹變性和過氧化物酶體增殖。出現(xiàn)氣球樣病變和嗜伊紅凋亡細(xì)胞,說明出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。在0.05mg/kg/day暴露的雌性小鼠中,觀察到了脂粒在肝細(xì)胞中的堆積,并通過進(jìn)一步的超薄切片透射電鏡觀察確認(rèn)。透射電鏡觀察還證明了中高濃度暴露組過氧化物酶體增殖。在除雄性最低劑量組外的其他組中,均觀察到隨劑量加深的細(xì)胞核固縮和線粒體形態(tài)變化,證實(shí)了凋亡的發(fā)生。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,線粒體的膜電位在出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的暴露組小鼠肝細(xì)胞中發(fā)生比例逐漸提高的喪失,進(jìn)而引發(fā)了Caspase-9酶體的激活,造成了小鼠肝細(xì)胞的凋亡。在所有測定指標(biāo)中,雌性小鼠在低濃度均較雄性更為敏感,低濃度PFOA對雌性小鼠造成的肝損傷更為嚴(yán)重。全氟己烷磺酸是另一種在人體中廣泛檢出,并具有很長代謝周期(8.5 yr)的全氟化合物,但是對其的毒理學(xué)研究還未深入展開。以相同的低中高劑量暴露于雌雄小鼠,在中高的兩個(gè)暴露劑量下,小鼠均出現(xiàn)了體重下降的情況,全氟己烷磺酸在小鼠的血液和肝臟中積累的情況和全氟辛酸類似,但是造成的肝腫大顯著弱于全氟辛酸,只在最高濃度的雌雄小鼠觀察到肝臟腫大的現(xiàn)象。病理切片顯示,只有低濃度的暴露組小鼠未發(fā)生肝臟的病變,在所有小鼠中均沒有觀察到顯著過氧化物酶體增殖現(xiàn)象,只在雌性的最高暴露劑量組出現(xiàn)了氣球樣變性和肝細(xì)胞的腫大,另外雖然也觀察到了脂粒在肝細(xì)胞中堆積的現(xiàn)象,但是只發(fā)生在雄性最高濃度組。超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn),過氧化物媒體增殖和凋亡現(xiàn)象只在中高暴露劑量下發(fā)生,且強(qiáng)度較弱,表明全氟己烷磺酸的肝毒性弱于全氟辛酸。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,全氟己烷磺酸引發(fā)線粒體膜電位散失和Caspase-9激活的能力均弱于全氟辛酸。為了進(jìn)一步理清全氟辛酸引發(fā)肝毒性的分子機(jī)制,我們使用iTRAQ技術(shù)測定了全氟辛酸暴露小鼠肝臟的蛋白組學(xué)變化,并用Western Blot驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示,在檢出并定量的～1800個(gè)蛋白中,超過三分之一的蛋白在任一暴露組均出現(xiàn)了表達(dá)上的顯著變化,這些變化的蛋白主要集中于線粒體上,表明全氟辛酸主要通過影響線粒體的功能而發(fā)生毒理作用。雌性較雄性更為敏感,在低劑量即出現(xiàn)大量的蛋白變化。之前的研究認(rèn)為PPARa信號通路誘導(dǎo)的活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生,可能是全氟辛酸引發(fā)小鼠肝細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。但是蛋白組結(jié)果顯示,雌性在最低劑量組中,由PPARa信號通路激活的脂肪酸β氧化和ω羥基化反應(yīng)相關(guān)的蛋白均未出現(xiàn)上調(diào),表明PPARa信號通路并未激活。PPARa基因半定量PCR也得到同樣結(jié)果,因此PPARa信號通路并不是全氟辛酸誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制。進(jìn)一步的分析顯示,p53信號通路上下游的關(guān)鍵蛋白PDCD5和CYCS均出現(xiàn)了上調(diào),表明p53通路被激活,從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生,導(dǎo)致凋亡。通過8-脫氧鳥苷的測定,我們確認(rèn)了小鼠肝細(xì)胞中出現(xiàn)了DNA的氧化損傷,這也是p53通路激活的主要誘因。由于p53通路具有非常強(qiáng)的保守性,在小鼠體內(nèi)觀察到的這一毒理機(jī)制,很可能也適用于人體,因此對于全氟辛酸的人體危害,我們需要針對性的采取防范措施。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X592
【圖文】：

圖１．２全球不同地區(qū)全l#辛酸和全l#己q<橫酸的人體血液檢出濃度逡逑根據(jù)正文１．２．３中文獻(xiàn)匯總，橫坐標(biāo)表示經(jīng)度，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道由谷歌地圖獲得。紅圈中逡逑２１逡逑

圖２．１邋ＰＦＯＡ在７種不同食物中的含量逡逑誤差線表不±ＳＤ，邋ｎ＝３

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2733971