【摘要】：篩選分離毒死蜱（chlorpyrifos，CP）降解微生物解決毒死蜱農(nóng)藥殘留給水體和土壤環(huán)境帶來的污染問題是一個可行的生物修復(fù)技術(shù)，對于研究農(nóng)藥殘留的生物降解具有重要意義。副球菌（Paracoccus sp.）TRP是一株對毒死蜱具有很強(qiáng)降解能力的菌株。本論文以其為研究對象，研究了菌株的基本特性，經(jīng)多種基因克隆方法相結(jié)合獲得一個新的毒死蜱降解酶基因，并研究了毒死蜱降解酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，研究內(nèi)容如下： 對本實(shí)驗(yàn)室篩選的TRP菌株進(jìn)行復(fù)壯，菌株在第2天到第4天對CP的降解最快，到第7天對50mg/L CP的降解率可達(dá)83.3%。菌株對5～100μg/mL Amp具有抗性；對5～100μg/mL Tc及Gm不具有抗性。菌株不能夠產(chǎn)生糖脂類陰離子生物表面活性劑。菌株組成型表達(dá)毒死蜱降解酶。 采用Solexa測序技術(shù)測定了副球菌TRP的基因組序列（GenBank登錄號AEPN00000000）�；蚪M大小約為3.9Mb，GC含量62.89%。預(yù)測所得CDS數(shù)為3961個。共得到155個代謝圖，其中25個與異源物質(zhì)代謝有關(guān)，包括除草劑阿特拉津代謝圖和脫氮代謝圖。在基因組序列上找到96個串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，200個轉(zhuǎn)座子，147個IS，45個tRNA和5套rRNA。副球菌TRP與Paracoccusdenitrificans Pd1222在進(jìn)化上關(guān)系較近，大部分基因的同源性較高。在副球菌TRP菌株中鑒定了與P. denitrificans Pd1222中類似的脫氮作用所需的所有四個氧化還原酶類基因。TRP菌株基因組的分析有助于鑒定多種不同的降解基因，進(jìn)一步闡明微生物降解毒死蜱代謝途徑。這是迄今為止關(guān)于毒死蜱降解副球菌菌株的基因組測序的首次報道。 從副球菌TRP中克隆得到了毒死蜱降解基因cpd，基因全長927bp，GC含量60.73%。cpd基因與目前已發(fā)表的有機(jī)磷降解酶基因的同源性較低，是一個新的有機(jī)磷降解酶基因。CPD蛋白由308個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為33.8kDa。帶電量為-7.0。等電點(diǎn)為4.8305。CPD蛋白是酯酶_脂酶超家族的成員之一，不僅具有Ser155-Asp251-His281催化三聯(lián)體和模序GDSAG，還具有酯酶保守的底物結(jié)合口袋ILYIHGGGWSFCSA。在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)的CPD融合蛋白大小約為53.9KDa，具有酯酶活性。CPD蛋白在行使酯酶功能時，不需要金屬離子；1mmol/L PMSF、1mmol/L DEPC和0.025%SDS顯著抑制其酯酶活力，0.025%Tween-20顯著增強(qiáng)其酯酶活力；CPD蛋白行使酯酶功能時需要Ser和His。在15min內(nèi)CPD酶液對50mg/L CP的降解率為63.5%±2.14。酶活力為59.62U/mg。將四環(huán)素Tc盒插入TRP菌株cpd基因中成功構(gòu)建cpd基因敲除的TRP△cpd菌株。5天內(nèi)，菌株TRP△cpd和TRP對50mg/L CP的降解率分別為27.3%和78.5%。TRP△cpd菌株對CP的降解率顯著降低，說明cpd基因在菌株TRP對毒死蜱的降解中起到主要作用。 CPD蛋白的三級結(jié)構(gòu)是由α螺旋、β折疊及無規(guī)卷曲高度折疊形成的緊密的球狀結(jié)構(gòu)。活性位點(diǎn)Ser155，Asp251和His281均位于β折疊鏈和α螺旋之間柔韌性較強(qiáng)的loop區(qū)域。CPD與CP分子對接表明: Ser155的側(cè)鏈羥基O原子與CP結(jié)構(gòu)中P原子的空間距離較近，易于發(fā)生親核攻擊，將CP降解為TCP和DETP。通過PCR技術(shù)將Ser155突變?yōu)锳la（S155A）。15min內(nèi)，CPD-S155A酶液對50mg/L CP的降解率為5.15%±1.03，酶活力為7.85U/mg。Ser155突變?yōu)锳la后，CPD蛋白對CP的降解率下降10余倍，說明Ser155在CPD對CP的降解中起到關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：X592;X172

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2730035