【摘要】：二甲戊靈[N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲苯胺],屬于二硝基苯胺類除草劑,是世界上銷售量第三大的除草劑及銷售量最大的選擇性除草劑,廣泛應用于防除旱田和菜田中的一年生禾本科雜草和某些一年生闊葉雜草。但二甲戊靈化學性質穩(wěn)定,在環(huán)境中殘留期較長,對水生生物及陸生無脊椎動物高毒,且具有潛在致癌性。因此研究二甲戊靈在環(huán)境中的遷移轉化等行為,闡明二甲戊靈在環(huán)境中的降解過程和機制,對于評估二甲戊靈應用后的環(huán)境行為、毒理和生態(tài)安全性具有重要意義。研究表明微生物降解代謝是環(huán)境中二甲戊靈消解的主要因素,近年來,已分離篩選到多株降解二甲戊靈的細菌和真菌,并鑒定了多個中間降解產(chǎn)物。但二甲戊靈微生物降解的代謝途徑全過程及參與其中的酶和基因至今還沒有得到闡明。同時,分離篩選高效的二甲戊靈降解菌株可用于研發(fā)二甲戊靈殘留污染生物修復技術,具有很強的應用價值。此外,除草劑降解/脫毒酶基因在抗除草劑轉基因工程領域具有潛在的應用價值,而我國目前還缺乏具有自主知識產(chǎn)權的性能優(yōu)良的除草劑降解/脫毒酶基因。抗除草劑轉基因工程可以極有效地控制農田雜草,其中最為成功的是抗草甘膦轉基因作物,已經(jīng)大量種植。但長期使用草甘膦帶來嚴重的雜草抗性問題,急需發(fā)掘其它除草劑降解/脫毒酶基因,為研發(fā)新的抗除草劑轉基因作物提供基因資源。二甲戊靈是一種廣泛使用的殺草譜較廣的除草劑,可作為抗除草劑轉基因工程的靶標除草劑,因此二甲戊靈降解/脫毒酶基因在構建抗除草劑作物中具有很好的應用前景。本論文利用微生物富集馴化技術從活性污泥中分離到一株高效的二甲戊靈降解菌株Y3,對該菌株進行了分類鑒定,利用高效液相色譜(HPLC)和串聯(lián)質譜(MS/MS)技術對菌株Y3降解代謝二甲戊靈的產(chǎn)物進行鑒定,發(fā)現(xiàn)了 2個新的代謝產(chǎn)物�？寺〉蕉孜祆`降解關鍵基因硝基還原酶基因pnr,研究了 PNR的酶學特性。本文從菌株、酶學和基因水平對二甲戊靈的微生物降解機制進行了闡述。研究結果為進一步深入研究二甲戊靈在環(huán)境中的降解規(guī)律和機制提供理論依據(jù),為研發(fā)二甲戊靈殘留污染土壤和水體生物修復技術提供高效降解菌株,為抗除草劑轉基因作物的構建提供具有我國自主知識產(chǎn)權的性能優(yōu)良的降解基因。本研究主要研究結果如下:1二甲戊靈降解菌株的分離篩選與鑒定以二甲戊靈為底物,通過富集馴化技術從處理二甲戊靈生產(chǎn)廢水的活性污泥中分離純化得到一株二甲戊靈高效降解菌株,命名為Y3。菌株Y3能以二甲戊靈為唯一碳源和能源生長,在36 h內能降解82%的100 mg/L二甲戊靈,60 h內能降解100%的100 mg/L二甲戊靈。菌株Y3在LB平板上菌落形態(tài)呈乳白色,邊緣褶皺不規(guī)則,菌落表面較干燥,革蘭氏染色呈陽性,菌體桿狀、好氧、產(chǎn)芽孢和周生鞭毛運動。16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析表明菌株Y3與Bacillus屬的親緣關系最近,與Bacillus subtilis菌株聚成一個分支。菌株Y3的16S rRNA基因序列與Bacillussubtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T 的 16S rRNA 序列相似性達到 99.9%,與Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB 3610T 的相似性為 99.4%,與Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T的相似性為99.1%。DNA-DNA雜交結果表明菌株Y3和Bacillus subtilis KCTC 13429T雜交率為75.3%,高于70%這一種間的界定閾值。結合菌株Y3的菌落形態(tài)特征、生理生化特征、16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析和DNA-DNA雜交,將菌株Y3鑒定為 Bacillus subtilis。菌株Y3降解二甲戊靈的最適溫度為30℃,最適pH為7.5。菌株Y3能降解二硝基苯胺類除草劑其他三種主要品種仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈,菌株Y3對二甲戊靈、仲丁靈和氨磺靈的降解速率沒有顯著差異,但對氟樂靈的降解速率顯著低于二甲戊靈。此外菌株Y3還能降解二苯醚除草劑乳氟禾草靈和乙羧氟草醚。2菌株Y3降解二甲戊靈的代謝產(chǎn)物鑒定和代謝途徑研究采用HPLC-MS/MS方法對菌株Y3降解二甲戊靈的代謝產(chǎn)物進行了鑒定。HPLC檢測到3個保留時間分別為8.92 min、4.85 min和4.5 min的產(chǎn)物峰,其[M+H]+分別為m/z252.17、m/z266.15和m/z250.12,經(jīng)MS/MS分析將這三個產(chǎn)物分別鑒定為6-氨基二甲戊靈、5-氨基-2-甲基-3-亞硝基-4-(戊烷基-3-氨基)-苯甲酸和8-氨基-2-乙基-5-(羥甲基)-1,2-二氫喹喔啉-6-羧酸。根據(jù)代謝產(chǎn)物鑒定結果推測菌株Y3降解二甲戊靈的部分代謝途徑為:首先通過硝基還原作用將二甲戊靈轉化成6-氨基二甲戊靈,進而又發(fā)生硝基還原作用和羧化作用生成5-氨基-2-甲基-3-亞硝基-4-(戊烷基-3氨基)-苯甲酸,隨后發(fā)生環(huán)化和羥基化作用得到8-氨基-2-乙基-5-(羥甲基)-1,2-二氫喹喔啉-6-羧酸。3菌株Y3中二甲戊靈硝基還原酶基因pnr的克隆與鑒定為克隆菌株Y3的二甲戊靈硝基還原酶基因pnr,首先通過硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析、疏水層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析等蛋白純化技術對菌株Y3的二甲戊靈硝基還原酶進行了純化。經(jīng)四步純化后,二甲戊靈硝基還原酶的比酶活由起始的0.38 U/mg protein提高到了 18.5 U/mg protein,目標蛋白濃縮了 48.7倍。純化得到的二甲戊靈硝基還原酶經(jīng)Native-PAGE電泳后割膠,利用MALDI-TOF-MS技術進行蛋白質肽指紋圖譜分析,將獲得的肽段序列與菌株Y3基因組框架圖中注釋的蛋白氨基酸序列進行匹配分析,結果找到一個注釋為硝基還原酶的 ORF(ORF03879)。將該 ORF 連入 pET29a(+)后導入Escherichia coli BL21(DE3)進行蛋白異源表達,產(chǎn)物通過親和層析純化。酶活測定結果表明純化的表達產(chǎn)物具有二甲戊靈硝基還原酶活性,比酶活為25.1 U/mg protein。UHPLC-MS/MS和1H NMR鑒定結果表明PNR催化了二甲戊靈芳環(huán)C-6硝基基團的還原,生成產(chǎn)物6-氨基二甲戊靈,說明該ORF就是pnr。PNR由209個氨基酸組成,編碼基因630 bp,蛋白分子量約為23 kDa。對蛋白氨基酸序列進行比對分析,PNR與B.subtilis subsp.strain 168中的一個功能未鑒定報道的NAD(P)H依賴型硝基還原酶YdgI有100%的序列相似性。在催化功能已鑒定并公開報道的硝基還原酶中,PNR與來源于Lactobacillus plantarum WCFS1的硝基苯甲酸硝基還原酶PnbA氨基酸序列相似性最高(僅35%),PNR與來源于Synechocystis sp.的醌還原酶DrgA有31%的氨基酸序列相似性,與Vbrio fischeri的NAD(P)H-flavin氧化還原酶Frase Ⅰ氨基酸序列相似性達到29%,與Pseudomonas putida的NAD(P)H-依賴型的氧化還原酶PnrB的相似性為28%。蛋白氨基酸系列系統(tǒng)發(fā)育進化分析表明二甲戊靈硝基還原酶PNR是Ⅰ型硝基還原酶GroupB亞家族B1中的一員。實時熒光定量PCR檢測結果表明pnr基因在菌株Y3中為組成型表達。4二甲戊靈硝基還原酶PNR的酶學特性研究PNR的最適反應pH為7.0,最適反應溫度為35℃;PNR在pH5.0或pH8.8,及溫度高于50℃時不穩(wěn)定。1.0mM的Li+、K+、Co~(2+)、Mn~(2+)和Ni~(2+)對酶活沒有顯著影響,1.0 mM的Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Fe3+對酶活有一定的促進作用,而1.0 mM的Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Ag+和Zn~(2+)對酶活有一定的抑制作用。100.0mMEDTA對酶活沒有明顯影響,100.0 mM SDS對酶活有微弱的抑制作用。100.0 mM還原劑DTT能顯著促進PNR的活性。PNR僅能催化二甲戊靈的芳環(huán)C-6位的硝基還原為氨基,不能催化芳環(huán)C-2位硝基的還原。此外,PNR還能連續(xù)催化仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈的兩個芳環(huán)硝基基團還原。PNR對二甲戊靈、仲丁靈、氨磺靈和氟樂靈的Vmax/Km分別為33.63、33.34、33.31 和 31.10。
【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X172;X592
【圖文】：

叫叩樷／／７？的降解效率最高，在２０邋ｄ內能完全降解１０邋ｍｇ／Ｌ二甲戊靈。Ｚ７！邋0＾７？0／７／／７？逡逑主要通過兩條途徑代謝轉化二甲戊靈：一是部分硝基還原生成６－氨基二甲戊靈（ＰＲ），逡逑二是通過Ｎ端脫烷基生成產(chǎn)物３，４－二甲基－２，６－二硝基苯胺（ＤＡ）（圖１－４）。／＞／ｃｉ／７如逡逑0ｎｒ＾Ｃａｖ也能有效降解二甲戊靈，降解率為７９％，生成的中間代謝產(chǎn)物是二甲戊靈逡逑９逡逑

靈的富集培養(yǎng)液。紫外－可見光掃描檢測發(fā)現(xiàn)含有土樣的處理組中的二甲戊靈含量明逡逑顯低于不添加土樣的ＣＫ組，２００？６００邋ｍｎ波長范圍內二甲戊靈的特征吸收峰明顯下降，逡逑說明二甲戊靈被大量降解了（圖２－１），土樣富集液中二甲戊靈被降解了邋４３邋ｍｇ／Ｌ。逡逑：．ｏｏｃ－邐？逡逑（１逡逑，魯一ＣＫ逡逑＾邋Ｉ邋．ＯＯＣ－邐１邐？逡逑０．５００－邋Ｖ邐＼邐－逡逑０．０００邐１邋＾逡逑２００．００邐３００邋００邐４００．ＪＫ）邐５００．００邋５５Ｕ逡逑ｎｍ逡逑圖２－１二甲戊靈降解富集液紫外－可見光掃描圖譜逡逑ＣＫ，二甲戊靈空白對照；處理，添加土樣的二甲戊靈富集液。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｌｉｇｈｔ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑ＣＫ，邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ；邋Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ逡逑ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｓｌｕｄｇｅ．逡逑將第四代富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，ｉ（ｒ４至ｉｃｒ７梯度稀釋液涂布于含］00邋ｍｇ／Ｌ二逡逑甲戊靈的ＭＳＭ平板上，３０°Ｃ培養(yǎng)２ｄ后，分離篩選得到７株菌株，將這７株菌株單逡逑菌落分別接種至２０邋ｍＬ邋ＬＢ液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)后期，離心收集菌體，逡逑用新鮮的ＭＳＭ洗滌２次后重懸菌體，然后按１％邋（ｖ／ｖ）的接種量接種至含１００邋ｍｇ／Ｌ逡逑二甲戊靈的２０邋ｍＬ邋ＭＳＭ中

【參考文獻】

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1 相振波;孫惠青;王秀國;張倩;楊立強;閆曉陽;宋超;徐金麗;鄭曉;方華;李義強;;二甲戊靈在煙草和土壤中的殘留消解動態(tài)和殘留量[J];農藥;2013年01期

2 吳兵兵;胡敏;張強;李二虎;李立斌;;二甲戊靈的GC和HPLC分析方法研究[J];化工中間體;2008年07期

3 霍江蓮;李軍;葛毅強;儲曉剛;;大豆中二硝基苯胺類除草劑多殘留的氣相色譜法定量檢測及質譜確證[J];分析化學;2006年S1期

4 霍江蓮;李軍;葛毅強;祁彥;儲曉剛;;二硝基苯胺類除草劑殘留檢測技術的研究進展[J];農藥;2006年04期

5 張宇,范志先,朱慶書,侯志廣,許允成;二甲戊靈在馬鈴薯及土壤上的殘留動態(tài)研究[J];青島科技大學學報(自然科學版);2005年02期

6 朱魯生,王軍,謝慧,劉偉,王秀國;二甲戊樂靈在土壤中的殘留分析[J];農藥;2004年11期

7 邵晨,蔣立琴,鮑偉利;除草劑施田補對鯽魚紅細胞核異常的誘導[J];農業(yè)環(huán)境保護;2002年03期

本文編號：2725678