【摘要】： 苯酚是工業(yè)排污中一種廣泛存在的污染物,苯酚的生物降解以及降解基因的表達調(diào)控機制的研究受到世界各國的高度重視。本研究在分離一株高效苯酚降解菌,醋酸鈣不動桿菌PHEA-2和克隆到苯酚降解基因簇(mph)的基礎上,采用反向PCR,啟動子-lacZ融合基因轉(zhuǎn)錄分析,引物延伸法,凝膠阻滯以及坐滴法結(jié)晶蛋白等方法,開展了醋酸鈣不動桿菌PHEA-2苯酚降解調(diào)控蛋白MphR的功能和結(jié)構(gòu)分析,以及mph基因簇表達調(diào)控機制的研究。 克隆了苯酚降解調(diào)控基因mphR,基因序列長1671bp,編碼556個氨基酸,預測蛋白分子量為63 kDa。序列分析表明MphR是XylR/DmpR家族調(diào)控蛋白,與醋酸鈣不動桿菌NCIB8250的苯酚降解調(diào)控蛋白MopR的氨基酸同源性是69.11%。通過轉(zhuǎn)錄活性分析實驗證明了MphR為苯酚羥化酶基因的正調(diào)控蛋白。另外,制備了MphR的蛋白晶體,為解析XylR/DmpR的蛋白結(jié)構(gòu)奠定了基礎。 為了研究MphR對苯酚降解的調(diào)控作用,我們對mphR和mphK基因起始密碼子之間的序列進行分析,發(fā)現(xiàn)這段序列含有σ70型的mphR基因的啟動子(PmphR)和σ54型(又被稱為-24/-12型)的mphK基因的啟動子(PmphK)。通過引物延伸法確定了mphK基因的轉(zhuǎn)錄起始位點是mphK起始密碼子ATG上游40個堿基處的G堿基。PmphK上游含有三個反向重復序列(IR1, IR2和IR3)和一個推測的整合宿主因子(IHF)的結(jié)合位點。構(gòu)建一系列截短的PmphK::lacZ融合表達載體,在大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶酶活測定結(jié)果顯示,IR1缺失的PmphK在2mM苯酚誘導時的β-半乳糖苷酶酶活提高了大約240%,因此認為IR1對PmphK的轉(zhuǎn)錄活性有抑制作用。IR1缺失的全細胞生物檢測菌PEMRP34對低濃度苯酚(0.1-5μM)的檢測靈敏性比對照菌株(PEMRP14)提高了100%。IR2缺失的PmphK失去轉(zhuǎn)錄活性,說明IR2是PmphK發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能所必不可缺少的,因此推測IR2和IR3是MphR在PmphK上的結(jié)合序列(又被稱為上游激活序列UAS)。含有PmphK::lacZ融合表達質(zhì)粒pGDP的PHEA-2菌中,PmphK::lacZ轉(zhuǎn)錄分析顯示在21種酚類衍生物中苯酚,鄰甲酚,間甲酚,鄰氯苯酚等9種酚類衍生物可以作為MphR的效應物激活PmphK的轉(zhuǎn)錄。PmphR::lacZ轉(zhuǎn)錄融合子分析發(fā)現(xiàn)mphR基因在PHEA-2菌中組成型表達,而且mphR基因?qū)ζ渥陨磙D(zhuǎn)錄有激活作用。 凝膠阻滯實驗進一步研究了MphR蛋白與PmphK之間的相互作用關系,研究結(jié)果表明His-MphR蛋白在體外能和苯酚羥化酶基因的啟動子結(jié)合,結(jié)合區(qū)域是IR2和IR3。將His-MphR蛋白分別和IR1,IR2和IR3進行凝膠阻滯試驗發(fā)現(xiàn),MphR蛋白可以分別與IR2和IR3結(jié)合,與IR2序列的結(jié)合能力最強。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：X172
【圖文】：

生型所不具備的苯酚降解能力(徐玉泉, 2001)。以上例子說明苯酚羥化酶對于苯酚及其衍生物的降解具有至關重要的作用。圖1.2 芳香族化合物的好氧降解代謝途徑。(Diaz, 2004)。Fig.1.2 The catabolic funnel for the aerobic degradation of aromatic compounds. White arrows, peripheral pathways;Black arrows, cleavage of the ring; Gray arrows, central pathway(Diaz, 2004).已發(fā)現(xiàn)的苯酚羥化酶有單組分和多組分兩種形式。單組分苯酚羥化酶結(jié)構(gòu)較為簡單(Kivisaar,Horak, Kasak, Heinaru, & Habicht, 1990; Kukor & Olsen, 1992)；而多組分苯酚羥化酶結(jié)構(gòu)比較復雜。多組分苯酚羥化酶是在環(huán)境中占優(yōu)勢的酶(Hino, Watanabe, & Takahashi, 1998; Watanabe,Teramoto, Futamata, & Harayama, 1998; Watanabe, Yamamoto, Hino, & Harayama, 1998)。單亞基苯酚羥化酶 Pseudomonas sp. EST1001的pheA和P. picketil PKO1的tbuD基因編碼產(chǎn)物是一種單亞基苯酚羥化酶，叫做黃素蛋白單加氧酶(Kivisaar et al., 1990; Kukor & Olsen, 1992; Massey,

圖1.4 細菌代謝芳香族化合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控示意圖。Fig.1.4 Schematic of the two levels of transcriptional regulation of aromatic catabolic pathways in bacteria.圖1.5 不同家族調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域的組成示意圖。(Tropel & van der Meer, 2004)。Fig.1.5 Schematic domain organization of different regulator families. The domain containing the HTH DNAbinding motif is indicated in black. The domain bound by the chemical inducer is indicated in white.

【共引文獻】

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本文編號：2723915