【摘要】：化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作用不可替代,而農(nóng)藥殘留污染的危害也日趨嚴重,這是人類亟需解決的一對矛盾。微生物原位修復(fù)被認為是解決這一矛盾的有效手段,相關(guān)的理論和應(yīng)用研究方興未艾。農(nóng)藥污染通常是涉及多種農(nóng)藥的混合污染,所以,相對于單一性降解菌株,具有廣譜降解性能的菌株在農(nóng)藥污染修復(fù)中更有實際的應(yīng)用價值;同時,農(nóng)藥殘留微生物降解分子機制的闡明也將為微生物修復(fù)提供理論指導(dǎo)。 在前期的工作中,本實驗室分離了一株廣譜農(nóng)藥降解菌Paracoccus versutus M-1。菌株M-1能夠降解有機磷殺蟲劑久效磷、敵敵畏、磷胺和酰胺類除草劑敵稗、乙草胺、丁草胺。該菌株及其開發(fā)的菌劑已申請了國家專利保護,并在應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用。本研究以菌株M-1為研究材料,試圖揭示其降解不同種農(nóng)藥殘留的分子機制,以期為其應(yīng)用提供理論參考。 1.菌株M-1的降解譜 M-1底物降解譜測定顯示,除了上述底物外,M-1還能降解有機磷殺蟲劑甲基對硫磷、甲基對氧磷和酰胺類化工中間體丙烯酰胺、苯甲酰胺、苯乙酰胺。在溫度30℃,pH7.5,裝液量為100/250mL,和1%接種量的加富培養(yǎng)基中,48小時,M-1對50ppm的甲基對硫磷和甲基對氧磷的降解效率分別為87.2%和93.4%。在溫度30℃,pH7.5,裝液量為100/250mL,和1%接種量的無機鹽培養(yǎng)基中,12小時,M-1對100ppm的丙烯酰胺、苯甲酰胺和苯乙酰胺的降解效率分別為96.3%、94.1%和89.20%. 2.敵稗水解酶基因的克隆及酶學(xué)研究 通過菌株在含敵稗的LB平板上產(chǎn)生水解圈的現(xiàn)象作為篩選標記,鳥槍法構(gòu)建菌株P(guān)aracoccus sp.Ml基因組文庫�？寺〕鲆粋�新的酰胺水解酶的基因pamh,該ORF大小為1434bp,編碼477個氨基酸,在起始密碼子ATG的上游5bp處有一可能的核糖體結(jié)合位點(AGGAGA), pamh的G+C含量為49.30%。pamh基因序列的Blast比對顯示,在氨基酸水平上與已鑒定的酰胺酶最高同源性為31%�；盍ξ稽c分析發(fā)現(xiàn)PamH具有酰胺酶特征家族的保守的Lys-Ser-Ser催化中心,將這三個位點分別突變?yōu)楸彼岷?PamH均喪失活力。因此確定PamH是屬于酰胺酶特征家族的一個新成員。 優(yōu)化了PamH在E. coli BL21中最佳表達條件：以LBP培養(yǎng)菌株,裝液量為150/500ml,置于搖床200rpm/min,菌體長到OD600=1.0時加入終濃度為0.005-0.01mM的IPTG,18-25℃,誘導(dǎo)表達8-10小時。其表達量比正常發(fā)酵時提高了20至30倍。經(jīng)過純化獲得單一的PamH,大小約為52KDa,與預(yù)測的分子量52,390Da相一致。等電點(pI)為5.13。 PamH在45℃以下和pH5.0～10.0時比較穩(wěn)定,PamH水解敵稗的最適溫度為40℃,最適pH為8.0。大部分金屬離子對PamH活力無影響,Hg2+, Co2+和Cu2+嚴重抑PamH的活力,而加入1mM的Mn2+和Mg2+對PamH的活力分別增強10%和30%。10mM的EDTA和1,10-菲羅啉對PamH活力無影響,說明PamH催化活力不需要金屬輔助因子。絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF則強烈抑制該酶的活力。巰基試劑pCMB和碘乙酰胺(1mM)以及表面活力劑SDS, Tween-80, Triton X-100(10mM)抑制PamH40-70%的活力。 PamH對大部分芳香族和短鏈脂肪族的酰胺化合物水解活力較高,如,乙酰胺,丙酰胺,苯甲酰胺和苯乙酰胺。苯甲酰胺苯環(huán)上一個或兩個C被N取代后,Pam對其水解活力明顯降低,如,PamH對尼克酰胺和吡嗪酰胺的催化活力比苯甲酰胺分別降低了43%和49%。在本實驗條件下,1mg的PamH在1min內(nèi)可以水解丙烯酰胺產(chǎn)生14.33μM丙烯酸,丙烯酸是生產(chǎn)聚合物的重要的工業(yè)原料。PamH還對部分氨基酸類的酰胺底物(天冬酰胺,丙氨酰胺和谷氨酰胺)和尿素有微弱的活力,而對長鏈脂肪族酰胺化合物正己酰胺未檢測到活力。PamH對敵稗的Km和Kcat分別是158μM和2.8s-1,在最佳反應(yīng)條件下的催化效率值為0.018μM-1·s-1。而其它被嘗試的敵稗類似結(jié)構(gòu)的酰胺化合物均不能被其水解,包括乙草胺,丁草胺,對硝基乙酰苯胺和對氯乙酰苯胺。 PamH還具有酰基轉(zhuǎn)移活力,以反應(yīng)生成1mM甲基異羥肟酸為100%酶活。PamH對甲酰胺和異丁酰胺具有很強的轉(zhuǎn)移能力相對活性分別為139%和178%。此外,PamH對芳基�；０坊衔锿瑯泳哂絮；D(zhuǎn)移酶活力,其對敵稗和對硝基乙酰苯胺的�；D(zhuǎn)移相對活性分別為34%和79%。 3.有機磷水解酶基因的克隆及酶學(xué)研究 通過鳥槍法構(gòu)建菌株P(guān)aracoccus sp.M1基因組文庫,獲得一個β-內(nèi)酰胺酶家族的甲基對氧磷水解酶基因mpdp, ORF大小為975bp,編碼324個氨基酸。mpdp基因序列的Blast比對顯示,在氨基酸水平上與已鑒定蛋白最高同源性為38%；與Pseudomonas sp Wbc-3中的甲基對硫磷水解酶MPH同源性為33%。并且Mpdp的序列中具有甲基對硫磷水解酶的保守序列His-X-His-X-Asp-His,因此確定Mpdp是屬于β-內(nèi)酰胺金屬酶家族的一個新蛋白。 Mpdp的底物譜較窄,僅對甲基對氧磷、甲基對硫磷和乙基對氧磷有催化活力。Mpdp水解甲基對氧磷Km和kcat值分別為286μM和14.8s-1。在最佳反應(yīng)條件下的催化效率值為0.052min-1μM-1。 通過易錯PCR獲得了5個活力提高的突變子,其中活力最高的Mpp1對甲基對氧磷、乙基對氧磷和甲基對硫磷的比酶活分別為81.4、5.8、0.72U/mg比原始酶活分別提高了11.2、7.1、4.5倍。在單位點突變中K160R、K176R和A276V的kcat/Km比原始Mpdp分別提高了2.3、10和4.5倍,而同時含有這三個突變位點的Mppl對甲基對氧磷的動力學(xué)參數(shù)kcat和kcat/Km比原始Mpdp分別提高9倍和24.5倍。
【圖文】：

生長代謝過程中產(chǎn)生二甲基硫代a愃帷⒀竅嵫魏捅嬌嶗轡鎦實拇恢屑洳鎩８萁峁治鐾撇餳諄粵騛惤到饌揪度繽，

本文編號：2679711