發(fā)布時間：2020-05-22 15:07

【摘要】：隨著經(jīng)濟發(fā)展和人們生活水平的不斷提高,越來越多的藥物及個人護理品類化合物(PPCPs)被人們用于日常生活。研究指出,這類物質(zhì)攝入后會有大約50-90%被排出體外,而常見的污水處理技術(shù)分解能力有限,剩余的PPCPs會通過污水處理廠排水進入環(huán)境。PPCPs的藥物機理又使其具有許多特殊的毒性效應,因而PPCPs污染正在受到人們越來越多的關(guān)注。長江河口區(qū)域毗鄰上海市,是中國人口最密集,工商業(yè)最發(fā)達的地區(qū)之一。上海市的污水主要向長江河口區(qū)域近岸水體排放,這就造成了PPCPs在長江河口近岸水體的持續(xù)輸入。在眾多的PPCPs污染物中,一些常用物質(zhì)的環(huán)境濃度已經(jīng)達到了較高的水平。鑒于可能存在的環(huán)境風險,有必要針對該區(qū)域一些典型的PPCPs污染物展開毒理學調(diào)查研究。基于已有數(shù)據(jù)和文獻報道,本研究選擇了他莫昔芬(TAM)、雙酚A(BPA)、布洛芬(IBP)、雙氯芬酸(DCF)和對乙酰氨基酚(PRCT)這五種常見的PPCPs作為調(diào)查的目標化合物。本研究首先利用斑馬魚胚胎/幼魚96小時急性毒性暴露實驗作為研究方法,從形態(tài)學、行為學和分子生物學等角度,調(diào)查了這些污染物的毒性效應。同時,本研究以上述實驗結(jié)果為基礎(chǔ),篩選了一些表現(xiàn)出普遍性和代表性的毒理學指標,探討了這些指標反應相關(guān)環(huán)境污染情況的潛力。最后,本研究采集了長江河口近岸水體的樣本,開展了環(huán)境水樣暴露實驗,分析了使用斑馬魚胚胎暴露實驗結(jié)合上述毒性指標檢測的方法在表征環(huán)境水樣污染時的有效性,并利用檢測結(jié)果對長江河口區(qū)域近岸水體的污染現(xiàn)狀和環(huán)境風險進行了評估。在形態(tài)學調(diào)查中,本研究發(fā)現(xiàn)TAM在最高濃度下(500μg/L)對96 hpf斑馬魚幼魚產(chǎn)生了一定的致畸效應。暴露組的幼魚體長變短,有輕度尾鰭缺損、表皮變暗、心率也出現(xiàn)了下降。后續(xù)的基因表達檢測顯示與表皮修復相關(guān)的krt17和egf基因的表達在TAM暴露組中有所上升,說明尾鰭缺損和表皮變暗是由于TAM對表皮組織的損傷造成的。在行為學調(diào)查中,本研究發(fā)現(xiàn)IBP和DCF的暴露會造成受試斑馬魚胚胎/幼魚的行為發(fā)生變化。在28 hpf的胚胎早期自發(fā)運動檢測中,IBP和DCF的存在會導致胚胎自發(fā)運動頻率下降,降幅最高可達25%和28%。在48-60 hpf的胚胎孵化過程中,IBP和DCF暴露均能造成顯著的孵化延遲,其在55 hpf時期的平均孵化率比對照組低63%和58%。在120 hpf的游泳行為檢測中,IBP暴露會造成幼魚黑暗條件下的自由游泳距離、時間和速度分別下降41%、29%和30%。DCF暴露則會造成幼魚在光暗交替刺激下光照周期中的游泳距離和游泳時間均出現(xiàn)下降,降幅最高為17%和15%。在后續(xù)的基因檢測中,與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的neurod1和neurog1基因的表達在IBP和DCF作用下發(fā)生了變化。這些結(jié)果顯示IBP和DCF能改變斑馬魚胚胎/幼魚的行為,并具有潛在的神經(jīng)毒性效應。在對內(nèi)分泌相關(guān)的基因進行檢測的過程中,本研究發(fā)現(xiàn)TAM和BPA的暴露對斑馬魚胚胎/幼魚內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達有顯著的影響。在TAM暴露實驗組中,斑馬魚幼魚體內(nèi)的esr1、cyp19a1b、ar、hsd3b2和ugt1a1基因的表達量均顯著升高,最高可達空白對照組的224%、2024%、153%、182%和154%,而vtg1基因的表達量則下調(diào)至空白對照組的71%。這些結(jié)果符合TAM選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)的身份。在BPA暴露實驗組中,斑馬魚幼魚體內(nèi)的esr1、cyp19a1b、ar、vtg1和ugt1a1基因的表達量也顯著升高,最高可達空白對照組的188%、1554%、134%、141%和205%。這些結(jié)果符合BPA環(huán)境雌激素的身份。鑒于TAM暴露使具有重要的雌激素效應的cyp19a1b基因的表達提高了20倍,所以本研究認為,TAM在斑馬魚胚胎/幼魚的早期發(fā)育過程中,主要表現(xiàn)為雌激素效應。在對代謝相關(guān)基因進行檢測的過程中,本研究發(fā)現(xiàn)所有的5種PPCPs都會不同程度的誘導斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)的代謝相關(guān)基因的表達,這反應了PPCPs污染對斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)代謝和抗氧化應激體系的壓力。在這些基因中,I相代謝相關(guān)的cyp3a65基因的表達受所有5種PPCPs的誘導(最高達336%),反映了其在斑馬魚代謝PPCPs過程中的重要性和普遍性。抗氧化應激體系相關(guān)的gpx1a和gsr基因的表達也受所有5種PPCPs的誘導(最高達184%和147%),表明了這兩個基因?qū)腉SH體系在斑馬魚對抗氧化應激過程中的重要作用。此外,cyp1a、gstp1和cat基因也受到復數(shù)種PPCPs的誘導(最高達160%、140%和142%),表明其在代謝體系中也具有較為通用的作用。實驗室暴露實驗結(jié)果表明,形態(tài)學指標中的體長、心率和畸形,行為學指標中胚胎早期自發(fā)運動和孵化速度,以及esr1、cyp19a1b、ar、vtg1、cyp1a、cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat等基因的表達變化,都具有表征環(huán)境中PPCPs污染情況的潛力。在隨后的環(huán)境水樣暴露條件下,可以觀察到上述指標不同程度的變化,這表明斑馬魚胚胎暴露實驗結(jié)合這些指標檢測的實驗方法可以用于表征低濃度的環(huán)境污染。利用上述實驗方法和毒理學指標,本研究對長江河口區(qū)域近岸水體的環(huán)境污染情況進行了檢測。研究所用的水樣采集自瀏河口(LHK)、石洞口(SDK)和吳淞口(WSK)。在形態(tài)學檢測中,SDK區(qū)域的水樣造成了受試胚胎/幼魚35.83%的死亡率,以及幸存幼魚的發(fā)育不良。在行為學檢測中,LHK和SDK區(qū)域的水樣造成了胚胎早期自發(fā)運動頻率增加(113%和121%)和孵化時間的顯著提前(10h和14h)。內(nèi)分泌相關(guān)基因的檢測顯示3個區(qū)域的水樣都具有復雜的環(huán)境激素作用,LHK區(qū)域的水樣誘導了cyp19a1b和ar基因的表達(133%和143%);SDK區(qū)域的水樣誘導了esr1、cyp19a1b和vtg1基因的表達(183%、120%和143%),但抑制了ar基因的表達(80%);WSK區(qū)域的水樣則誘導了esr1和ar基因的表達(135%和123%)。代謝相關(guān)基因表達的檢測則表明LHK和SDK區(qū)域的水樣對斑馬魚幼魚的代謝和抗氧化機制存在干擾作用,LHK區(qū)域的水樣誘導了cyp1a基因的表達(242%),但抑制了cyp3a65、gpx1a和sod1基因的表達(53%、77%和84%);SDK區(qū)域的水樣則廣泛的抑制了cyp3a65、gpx1a、gstp1、gsr、gss、sod1和cat基因的表達(10%、63%、77%、85%、83%、64%和44%)。這些結(jié)果表明,LHK、SDK和WSK區(qū)域的近岸表層水均存在明顯的環(huán)境風險,長江河口區(qū)域近岸水體的污染情況不容樂觀。
【圖文】：

圖 2-1 長江河口區(qū)域地圖Fig. 2-1 Area map of the Yangtze River Estuary2.2 目標化合物本研究對目標物的篩選基于已有的文獻資料和本學院其他相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)。先前的調(diào)查表明，長江口區(qū)域近岸水體中包含的 PPCPs 污染物種類繁多，但是多數(shù)物質(zhì)的濃度較低，僅有一些常見 PPCPs 的含量可以達到數(shù)十至數(shù)百 ng/L 的水平（Yang et al., 2011b；Shi et al. 2014；Wu et al., 2014；Zhao et al., 2015）。這些物質(zhì)對 PPCPs 造成的環(huán)境風險的整體貢獻較大。因此在篩選暴露實驗的目標化合物時，本研究綜合考慮了上述調(diào)查數(shù)據(jù)、藥物的作用機理和已有的研究報道，最終選定以下 5 種 PPCPs 作為斑馬魚胚胎/幼魚急性毒性實驗的目標化合物：他莫昔芬（TAM）、雙酚 A（BPA）、布洛芬（IBP）、雙氯芬酸（DCF）、對乙酰氨

圖 2-2 目標化合物的離子色譜圖（使用 50 μg/L 標準溶液進行檢測）Fig. 2-2 Chromatograms of target compounds in 50 μg/L standard solution2.3.8 數(shù)據(jù)分析本研究所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤差（SEM）的形式記錄。對于需要進行統(tǒng)計分析比較的數(shù)據(jù)組，首先需要進行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗。行為學測試的一系列結(jié)果符合方差齊性，故對這些數(shù)據(jù)組的分析比較使用了單因素方差分析法（one-wayANOVA），后續(xù)兩兩比較使用了 Tukey 檢驗。其余實驗所得到的數(shù)據(jù)組多數(shù)不符合方差齊性條件，故不適合使用 one-wayANOVA 進行分析。但是這些數(shù)據(jù)組均符合正態(tài)分布，因此本研究使用了雙尾異方差 T 檢驗來比較這些試驗中處理組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)之間的差異。對于這兩種分析檢驗，，本研究均選擇概率 P < 0.05 為顯著性差異標準。所有實驗數(shù)據(jù)均由 Origin 8.5 軟件處理分析。
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X171.5

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本文編號：2676179