【摘要】：生物材料聚乳酸是受到廣泛關(guān)注的生物相容性良好和全生物降解材料，由乳酸聚合而成。如果聚乳酸單體乳酸能夠從廉價(jià)的生物質(zhì)資源通過(guò)生物煉制轉(zhuǎn)化而來(lái)，則無(wú)論對(duì)醫(yī)學(xué)發(fā)展、環(huán)境保護(hù)還是資源節(jié)約都具有重要意義。乳酸是基本的有機(jī)酸之一，是一種重要的平臺(tái)化合物，實(shí)現(xiàn)生物煉制生產(chǎn)也是未來(lái)生物基經(jīng)濟(jì)代替石油基經(jīng)濟(jì)的重要產(chǎn)業(yè)組成。要實(shí)現(xiàn)生物煉制生產(chǎn)乳酸目前尚有一些技術(shù)瓶頸需要被攻克，最主要的有兩點(diǎn)，一是將木質(zhì)纖維素原料低成本、高效率的轉(zhuǎn)化成可生物利用的小分子糖類；二是生物發(fā)酵纖維素來(lái)源的糖類高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乳酸。目前該領(lǐng)域的技術(shù)積累還不能完全滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益還不能與以石油為基礎(chǔ)的產(chǎn)業(yè)相比。本研究將針對(duì)這兩大技術(shù)瓶頸，圍繞農(nóng)作物秸稈木質(zhì)纖維素的高效糖化技術(shù)、米根霉固定化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸等內(nèi)容展開(kāi)研究。 我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈資源豐富，在各類秸稈資源中尤其以玉米秸稈最為豐富。如何提高玉米秸稈的糖化效率是利用該資源進(jìn)行生物煉制，用于生產(chǎn)平臺(tái)化合物的關(guān)鍵。在利用纖維素酶水解玉米秸稈纖維素生產(chǎn)葡萄糖的過(guò)程中，秸稈的致密結(jié)構(gòu)是酶解β-1,4-糖苷鍵的主要障礙，本研究中我們采用蒸汽爆破技術(shù)對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，以提高纖維素酶解效率。 在蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈的研究中，以酶解還原糖產(chǎn)率為響應(yīng)值，采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)得到最佳汽爆工藝條件，即汽爆壓力2.2MPa、液固比1:1、維壓時(shí)間9min、物料顆粒度40-60目。在此工藝條件下酶解還原糖產(chǎn)率是未處理原料的1.97倍�；瘜W(xué)組分分析顯示，蒸汽爆破處理后秸稈物料中纖維素含量及木質(zhì)素含量相對(duì)于原料分別增加了29.73%和19.65%，說(shuō)明通過(guò)蒸汽爆破預(yù)處理能夠提高秸稈物料中纖維素的相對(duì)含量。SEM觀察可見(jiàn)，蒸汽爆破處理后其結(jié)構(gòu)破壞明顯，表面出現(xiàn)褶皺，結(jié)構(gòu)變的蓬松，比表面積增大。 以優(yōu)化工藝對(duì)玉米秸稈進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，然后進(jìn)行水/醇抽提處理，將纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等組分進(jìn)行分離，進(jìn)一步提高纖維素酶的可及性。對(duì)底物濃度、纖維素酶用量、酶解反應(yīng)時(shí)間等因數(shù)采用單因素分析和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。以酶解還原糖產(chǎn)率為響應(yīng)值，對(duì)回歸方程求解得到的最佳工藝條件為：底物濃度53.28g/L，纖維素酶用量53.32FPU/g，酶解時(shí)間60.45h，此工藝條件下還原糖產(chǎn)率的最大預(yù)測(cè)值為694.11mg/g。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，得到酶解后還原糖產(chǎn)率為672.36mg/g，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近。在相同酶解工藝條件下，經(jīng)過(guò)蒸汽爆破-水/醇處理后物料酶解還原糖產(chǎn)率較原料提高了170.46%，較單純蒸汽爆破后物料提高了28.97%�；瘜W(xué)組分分析顯示，水/醇處理能有效分離纖維素、半纖維以及木質(zhì)素，進(jìn)一步提高物料中的纖維素含量，SEM圖譜也顯示水醇處理使秸稈物料的結(jié)構(gòu)變的更加的蓬松，這些因素可有效增加纖維素酶對(duì)纖維素的可及性，提高了酶解效率。 為了克服絲狀真菌發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)不易控制，機(jī)械運(yùn)動(dòng)易造成菌絲斷裂損傷；會(huì)形成大的菌絲團(tuán)，阻礙氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞等不利生產(chǎn)的特點(diǎn)。對(duì)米根酶固定化發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了研究，包括固定界面的選擇、固定支架的設(shè)計(jì)以及固定化效果的評(píng)價(jià)。并利用玉米秸稈水解物為主要碳源，篩選出適合利用水解物發(fā)酵產(chǎn)酸的米根霉菌種，采用固定化發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行了搖瓶和反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究，優(yōu)化了發(fā)酵工藝。 通過(guò)多種米根霉和乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸的比較，篩選出米根霉As3.3462菌種是適合發(fā)酵玉米秸稈酶解物生產(chǎn)乳酸的菌種。為了制作出適合米根霉固定化發(fā)酵的固定支架，試驗(yàn)篩選出棉布是用于米根霉固定的良好纖維表面，六角星形載體菌絲層層固定后仍具有較大的表面積，多棱角的結(jié)構(gòu)使菌絲層內(nèi)部具有較好的物質(zhì)傳輸特性，適合菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。通過(guò)孢子固定動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，米根霉孢子能完全固定在載體上，隨著菌絲的生長(zhǎng)，吸附率急劇上升。通過(guò)對(duì)孢子固定動(dòng)力曲線的數(shù)學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)孢子的吸附符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征。載體尺寸、數(shù)量與反應(yīng)器容量以及孢子接種量間對(duì)于菌體生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)存在最佳比例關(guān)系。通過(guò)100mL的搖瓶實(shí)驗(yàn)，直徑2.5cm、3個(gè)載體、1×106/mL的孢子接種濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸生產(chǎn)最為有利。 進(jìn)一步研究As3.3462米根霉固定化發(fā)酵玉米秸稈水解物生產(chǎn)L-乳酸。為了了解米根霉對(duì)玉米秸稈水解物的代謝特性，分別研究米根霉對(duì)葡萄糖和木糖的代謝，揭示木糖代謝的磷酸戊糖途徑乳酸轉(zhuǎn)化率低，但能有效提高生物量，以玉米秸稈水解物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸主要通過(guò)葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化。通過(guò)葡糖糖和木糖混合模擬玉米秸稈水解物，從糖消耗的動(dòng)力學(xué)分析，米根霉優(yōu)先消耗葡萄糖，對(duì)木糖的消耗需要經(jīng)歷一段時(shí)間的“適應(yīng)性”調(diào)整，乳酸生成主要在葡萄糖消耗階段。玉米秸稈水解物包含22.8%的葡萄糖和27.2%的木糖，其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與1:1的混糖模擬類似。隨著葡萄糖被迅速消耗，木糖的消耗速度逐漸提高，發(fā)酵176h時(shí)乳酸生產(chǎn)水平達(dá)到最大15g/L，轉(zhuǎn)化率約30%，整個(gè)過(guò)程伴有乙醇的生成。在單因素分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化了同步糖化發(fā)酵，使糖化和發(fā)酵過(guò)程良好耦合，秸稈轉(zhuǎn)化率接近15%。 采用本室自行設(shè)計(jì)制作的鼓泡式生物反應(yīng)器，對(duì)米根霉固定化發(fā)酵的工藝進(jìn)行了放大研究�？疾炝朔磻�(yīng)器中孢子的吸附和萌發(fā)狀況，結(jié)果顯示，通氣對(duì)孢子固定具有干擾作用，在0.5vvm的通氣量下需要10h萌發(fā)的孢子才能全部固定。通過(guò)對(duì)菌絲層的通氣特性分析顯示，菌絲層厚與氧氣傳輸速率間非線性，超過(guò)15mm的臨界厚度，菌絲層會(huì)嚴(yán)重阻礙氧的傳輸，提示固定發(fā)酵的菌絲層厚要控制在15mm的范圍內(nèi)。通過(guò)比較固定發(fā)酵和游離發(fā)酵，前者乳酸轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到72%，而后者只有40.4%，固定發(fā)酵顯著優(yōu)于游離發(fā)酵。同時(shí)進(jìn)行了重復(fù)批次發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵的研究，重復(fù)批次發(fā)酵可以連續(xù)發(fā)酵6批次，乳酸轉(zhuǎn)化率保持在40%以上，同步糖化發(fā)酵可以達(dá)到57%的轉(zhuǎn)化率。 綜上所述，為了有效的將玉米秸稈纖維素轉(zhuǎn)化成L-乳酸，我們對(duì)玉米秸稈的物理和化學(xué)的預(yù)處理技術(shù)、生物酶解糖化技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，建立了一種成本低、環(huán)境污染小、效率高的玉米秸稈木質(zhì)纖維素糖化技術(shù)，為玉米秸稈資源用于生物煉制奠定了基礎(chǔ)。接著以米根霉發(fā)酵玉米秸稈水解物生產(chǎn)L-乳酸為目的，篩選出了適合發(fā)酵產(chǎn)酸的米根霉菌種As3.3462，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)米根霉對(duì)葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化途徑的差異性，為有效利用秸稈資源提出了新思路。通過(guò)不同性質(zhì)的材料對(duì)比篩選出適合米根霉固定的纖維材料，以增大表面積、提高菌團(tuán)內(nèi)部物質(zhì)傳輸為目的，設(shè)計(jì)出了一種具有優(yōu)化幾何形狀的固定化載體，并用于玉米秸稈水解物的固定化發(fā)酵研究。根據(jù)該固定化特點(diǎn)，設(shè)計(jì)制作了鼓泡式生物反應(yīng)器用于工藝放大研究，，通過(guò)建立氣竄實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，分析了玉米秸秸稈水解物發(fā)酵液中的溶氧特性和菌絲層中溶氧傳輸特性，確定了反應(yīng)器通氣控制。利用優(yōu)化的工藝進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵試驗(yàn)，證實(shí)該固定化發(fā)酵技術(shù)具有較好的穩(wěn)定性和較高的轉(zhuǎn)化效率，以此研究為基礎(chǔ)有望開(kāi)發(fā)出滿足產(chǎn)業(yè)化的玉米秸稈轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-乳酸的工藝和設(shè)備。
【圖文】：

若將三種組分的酶分離則水解過(guò)程不能持續(xù)進(jìn)行下去，說(shuō)明三種纖間是相互協(xié)同的關(guān)系，一種酶的產(chǎn)物是另一種酶的底物[71-75]。纖維素酶關(guān)系如圖 1.2 所示，β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶在整酶解作用關(guān)系中處于中心地在 Cx 酶的作用下纖維素大分子被酶解成不溶性或可溶性纖維寡糖，然酶的作用能夠直接水解生成葡萄糖，也可通過(guò) C1酶的作用下水解產(chǎn)生纖進(jìn)一步被 CB 酶水解得到葡萄糖，C1酶能將纖維素大分子水解成為纖維維三糖，但不能直接水解成為葡萄糖。C1酶的作用過(guò)程可以被分成兩個(gè)先將纖維素分解為纖維二糖，然后纖維二糖被水解成葡萄糖。但是纖維量積累對(duì) Cx 酶和 C1酶都會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，所以可通過(guò)補(bǔ)充外源高纖維二糖的水解速率，消除抑制效應(yīng)促進(jìn)整個(gè)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)反應(yīng)的進(jìn)行，葡萄糖的積累對(duì)于 CB 酶的酶解作用也會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作在酶解過(guò)程中不斷的移除酶解產(chǎn)物，對(duì)于提高酶解效率非常重要，目前些膜分離技術(shù)，或通過(guò)同步糖化發(fā)酵技術(shù)邊糖化邊消耗，促進(jìn)酶解過(guò)程,78]。

圖 1.4 米根霉生產(chǎn)乳酸、富馬酸、乙醇的代謝途徑Figure1.4 Pathways for production of lactic acid, fumaric acid, and ethanol in R. oryzae. (Llactate dehydrogenase; ADH: alcohol dehydrogenase)發(fā)酵方式在發(fā)酵方式的選擇上需要考慮發(fā)酵菌種、底物特點(diǎn)等。目前利用最為廣泛發(fā)酵方式是分批發(fā)酵，也稱間歇發(fā)酵。該發(fā)酵工藝的特點(diǎn)是技術(shù)要求低，工單，但是生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且發(fā)酵產(chǎn)率較低，乳酸收率大約在 45%，勞動(dòng)強(qiáng)度大前工業(yè)上采用的碳酸鈣-間歇發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的廢渣，造成環(huán)境污染，因此目?jī)?nèi)外都在積極探索新的發(fā)酵工藝[82,87]。相對(duì)于分批發(fā)酵，連續(xù)化發(fā)酵具有更加高效的優(yōu)勢(shì)，是發(fā)酵工藝、反應(yīng)器的主要研究方向。連續(xù)發(fā)酵的控制比較困難，要實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，需要在連續(xù)裝置上多次實(shí)驗(yàn)，找出菌體、底物、產(chǎn)物的相關(guān)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，使底物消耗、生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。連續(xù)化發(fā)酵的缺點(diǎn)是微生物容易發(fā)生遺傳變?nèi)揪�。因此連續(xù)化發(fā)酵的連續(xù)性是有限的，一般為數(shù)月至一、兩年，即便如
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：X712

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2657019